Давно я хотела написать про антинуклеарный фактор, но меня все время что-то останавливало. Почему? Ну потому что писать об этом — это пытаться объять необъятное, а краткость — явно не сестра моего таланта)))
Определение антинуклеарного фактора (АНФ) -основной метод выявления антинуклеарных антител, который позволяет выявить большинство разновидностей антинуклеарных антител. Результатом определения АНФ является сам факт присутствия аутоантител, конечный титр разведения сыворотки и тип свечения ядра клетки.
АНФ-это не одно антитело!
Метод выявления АНФ был разработан Таном (1982), применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2 (вы могли видеть это название в бланке анализа). Это клеточная линия получена из опухоли гортани человека (аденокарциномы). Сравнительная неприхотливость этой линии, крупные ядра и присутствие всех человеческих антигенов сделало метод непрямой иммунофлюоресценции (нРИФ) с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ.
В качестве субстратов могут применяться и другие клеточные линии (см карусель), однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линия Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. В англоязычной литературе иногда этот метод обозначают как FANA(Fluorescent AntiNuclear Antibody detection).
Иногда под термином «антинуклеарные антитела» иммунологические лаборатории называют тесты, как основанные на методах иммуноферментного и иммунохимическом анализе, так и метод иммунофлюоресценции.
Антинуклеарный фактор (АНФ) — это антитела, обнаруженные иммунофлюресцентным методом.
Необходимо выявлять АНФ класса IgG, так как выявление АНФ, представленных другими классами иммуноглобулинов не имеет самостоятельного значения.
Титр АНФ определяется как последнее разведение сыворотки больного, которое обладает четкой флюоресценцией (свечением) ядер клеток. При использовании клеточной линии НЕр-2 рекомендуется использовать исходный титр 1:80, в этом случае в норме титры АНФ менее 1:160. Для определения конечного титра обычно используется титрование шагом х2 (1:160-1:320 — 1:640 — 1:1280 – 1:2560 – 1:5120 и т.д.).
На фоне обострения заболевания обычно отмечаются титры АНФ более 1:640, а при ремиссии титры могут снижаться до 1:160-1:320.
Балльная оценка результатов выявления («в крестах» +++) позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполение исследований. В этом случае определение конечного титра не представляется возможным❌
Желательно определять конечный титр у всех положительных больных, что позволяет уточнять присутствие в сыворотке аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса.
ТИПЫ СВЕЧЕНИЯ ЯДРА
Тип свечения ядра — одна из ключевых характеристик при выявлении АНФ. Каждая разновидность антинуклеарных антител (ANA) имеет конкретные мишени в клетке и отражает взаимодействие сыворотки больного с структурами внутри клетки. Тип свечения зависит от присутствия конкретных аутоантител в крови, на основе чего, можно сделать предварительное заключение относительно тех разновидностей антител, которые имеются в данной сыворотке. Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ.
Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, однако для клинической практики достаточно выделить основные. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого.
При гомогенном типе свечения аутоантитела реагируют с теми антигенами, которые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина.
За счёт чего? Антитела против нуклеосом, ДНК, гистонов.
Когда? У больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией.
Часто обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения указывает на диагноз СКВ.
Периферический тип свечения могут выделять отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного. Периферический тип свечения обнаруживается у больных с антителами к двуспиральной ДНК и выявляется преимущественно при СКВ, заболеваниях печени.
Гранулярный тип (крапчатый, сетчатый) является наиболее частым встречающимся и, одновременно, наиболее неспецифическим.
За счёт чего? Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA.
Когда? СКВ, болезнь/синдром Шегрена, склеродермия, дерматомиозит/полимиозит, РА и ряда других болезней. Низкие титры (1:160-1:320) АНФ с гранулярным типом свечения могут быть в сыворотках крови у клинически здоровых лиц БЕЗ признаков системного заболевания.
Выявления очень высоких титров АНФ (1:2560-1:10000) с крупногранулярным типом свечения ядра обычно указывает на диагноз и требует дообследования для выявления RNPантигена.
Антигены ядрышка могут выступать в качестве мишеней АНА, что приводит к обнаружению ядрышкового типа флюоресценции.
За счёт чего? PHК полимераза 1, NOR, U3RNP, PM/Scl.
Когда? Склеродермия и ее разновидности.
Центромерный тип отмечается при появлении антител к центромерам хромосом, и обнаруживается только в делящихся клетках. Его присутствие характерно при CREST-синдроме (вариант склеродермии).
Цитоплазматический тип свечения.
За счёт чего? Антитела к тРНК–синтетазам, в частности Jo-1, которые отмечаются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: при аутоиммунном гепатите, при первичном билиарном циррозе.
Можно охарактеризовать ряд других разновидностей свечения. Антитела к Scl-70 дают мелкогранулярное окрашивание ядра и ядрышек, анти-р80 — светящиеся точки в ядре, которые отсутствуют в митотических клетках.
Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70.
Иногда в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях выявляется гомогенный или центромерный типы флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА.
Общая информация об исследовании
Определение антинуклеарного фактора (АНФ) является "золотым стандартом" выявления антинуклеарных антител (АНА) и диагностики аутоиммунных заболеваний.
Патогенез системных заболеваний соединительной ткани (СЗСТ) тесно связан с нарушениями в иммунной системе и повышенной выработкой антител к структурам собственных клеток. Аутоантитела к компонентам ядра клеток – антинуклеарные антитела – взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и белками ядра, антигенами цитоплазмы, что проявляется воспалительными изменениями в тканях и органах, болями в суставах и мышцах, выраженным утомлением, потерей веса, кожными изменениями. АНА обнаруживаются при многих аутоиммунных заболеваниях, но наиболее характерны для системной красной волчанки (СКВ). АНА встречаются более чем у 90 % больных системными заболеваниями соединительной ткани, в настоящее время описано около 200 разновидностей, которые объединены единым названием – антинуклеарный фактор.
При определении АНФ методом непрямой флюоресценции чаще используется перевиваемая линия эпителиальных клеток аденокарциномы гортани человека НЕр-2. Клетки НЕр-2 являются очень удобным субстратом для лабораторного исследования, так как обладают крупными ядрами и на стеклах растут в один слой. АНА выявляются при связывании с внутриклеточными антигенами клеток НЕр-2.
При исследовании эпителиальные клетки НЕр-2 выращивают на стеклах, фиксируют и инкубируют с разведенной сывороткой крови пациента. После удаления избытка сыворотки клетки инкубируют с меченными флюоресцеином антителами, затем снова промывают и исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа. При этом определяется титр антител и тип свечения. Диагностически значимым считается титр более 1:160. При обострении ревматических заболеваний он превышает 1:640, а в период ремиссии снижается до 1:160-1:320. Чем больше антител, тем выше титр. По типу свечения можно установить мишени антинуклеарных антител, что имеет важное клиническое значение и определяет тактику дальнейшего обследования пациента. Основными являются периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы окрашивания ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого.
Гомогенное (диффузное) окрашивание связано с наличием антител к двуспиральной ДНК, гистонам и характерно для СКВ и лекарственной волчанки.
Периферическое свечение обусловлено периферическим распределением хроматина в ядре, связано с антителами к ДНК и специфично для СКВ. Данный тип свечения важно дифференцировать от окрашивания ядерной мембраны, которое происходит при аутоиммунных заболеваниях печени.
Гранулярное (крапчатое, сетчатое) окрашивание встречается наиболее часто и является наименее специфичным, выявляется при многих аутоиммунных заболеваниях. Аутоантигенами в данном случае выступают нуклеопротеиновые комплексы в ядре (Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA).
Очень высокие титры АНФ с крупногранулярным типом свечения часто указывают на смешанное заболевание соединительной ткани.
Нуклеарное (ядрышковое) окрашивание обусловлено антителообразованием к компонентам ядрышка (PHК-полимераза-1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl), выявляется при склеродермии, болезни Шегрена. АНА иногда повышаются при эндокринных заболеваниях (сахарном диабете 1-го типа, тиреоидите, тиреотоксикозе, полиэндокринном синдроме), кожных заболеваниях (псориазе, пузырчатке), при беременности, после трансплантации органов и тканей, у больных на гемодиализе.
Центромерное свечение появляется при наличии антител к центромерам хромосом и характерно для формы склеродермии – CREST-синдрома.
Цитоплазматический тип свечения связан с антителами к тРНК-синтетазе, в частности к Jo-1, что характерно для дерматомиозита и полимиозита. Данный тип окрашивания также определяется при наличии антител к другим компонентам цитоплазмы при аутоиммунном гепатите, первичном билиарном циррозе.
Одновременное выявление различных типов свечения указывает на присутствие разных видов антител.
У здоровых людей может быть обнаружено мелкогранулярное свечение при низких, умеренных или высоких титрах АНА, но в норме крупнозернистые или гомогенные типы свечения не должны определяться.
В зависимости от результатов оценки типа свечения разрабатывается дальнейшая тактика лечения пациента и назначаются дополнительные исследования, уточняющие спектр АНА.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Существует ряд заболеваний, при которых защитная система принимает клетки собственного организма за чужеродные, после чего начинает ошибочно их атаковать. Большинство аутоиммунных патологий имеют хроническую форму и представляют серьезную угрозу для здоровья. Для того чтобы выявить данные недуги на самой ранней стадии их развития, врачи назначают анализ АНФ. Данная аббревиатура расшифровывается как «антинуклеарный фактор». В некоторых заключениях исследование помечается как АНА. Значение расшифровывается как «анализ на антинуклеарные антитела». АНФ - это клинически значимый показатель, помогающий врачу составить максимально эффективную схему лечения и не допустить развития осложнений.
Биологическим материалом для исследования является кровь. При проникновении в организм любого патогенного микроорганизма иммунная система начинает вырабатывать специфические антитела, задачей которых является уничтожение чужеродных антигенов. Суть метода и заключается в обнаружении и количественном определении этих веществ в жидкой соединительной ткани.
Врачи утверждают, что АНФ-анализ крови - это лабораторный имеющий высокую степень информативности. С его помощью возможно выявить любые аутоиммунные патологии даже на ранней стадии их развития.
Специфические антитела также нередко выявляются у людей, страдающих от тяжелой формы гепатита, онкологии и некоторых инфекционных заболеваний. Данные вещества могут быть обнаружены и у здоровых людей. Подобная ситуация требует комплексного подхода для выявления причины.
АНФ-анализ иногда подразумевает оценку количественного содержания иммуноглобулинов. Их наличие может свидетельствовать о развитии коллагенозов и заболеваний ревматического характера.
Важно знать, что АНФ-анализ крови - это исследование, которое назначается с целью подтверждения или исключения наличия аутоиммунных патологий, а также для оценки эффективности проведенного лечения.
Заподозрить недуг врач может по следующим симптомам:
Кроме того, АНФ-анализ назначается при подозрении на наличие ревматического заболевания. Исследование проводится после получения результатов лабораторной диагностики, в которых увеличены показатели СОЭ, ЦИК и С-реактивного белка.
АНФ-анализ крови позволяет выявить патологии аутоиммунного характера. Исследование информативно в отношении следующих заболеваний:
Это неполный список заболеваний. Важно, что анализ АНФ показывает развитие аутоиммунных патологий на самой ранней стадии их течения. Это позволяет врачу определиться с тактикой лечения, а в дальнейшем оценить его эффективность.
Забор биоматериала осуществляется в утренние часы. Сдавать кровь необходимо натощак. Последний прием пищи должен быть совершен минимум за 4 часа. При этом пить воду допустимо в любое время и в любых количествах. Под запретом употребление алкоголя.
За 1 день до исследования показан покой. Физические и психоэмоциональные нагрузки нередко приводят к ложному результату. За полчаса до сдачи крови запрещено курить.
Необходимо поставить в известность врача о принимаемых медикаментах во время назначения им анализа АНФ. Это обусловлено тем, что активные компоненты некоторых препаратов провоцируют выработку антител и также могут стать причиной лекарственной волчанки. Ложноотрицательные результаты нередко являются следствием приема глюкокортикостероидов.
Если пациенту были назначены физиопроцедуры или инструментальные обследования, их необходимо проводить только после сдачи крови.
Он осуществляется в утренние часы. Биологическим материалом является венозная кровь. Ее забор проводится согласно стандартному алгоритму. Как правило, кровь берется из вены, расположенной на локтевом сгибе.
После того как жидкая соединительная ткань будет получена, из нее выделят сыворотку. Именно она необходима для проведения анализа.
В настоящее время обнаружить антитела в биоматериале возможно несколькими способами:
Расшифровкой АНФ-анализа должен заниматься лечащий врач. При наличии положительных результатов исследований назначаются дополнительные тесты. Окончательный диагноз не ставится на основании заключения одного анализа.
Наилучшим результатом является тот, при котором антинуклеарные антитела отсутствуют. Однако стоит помнить о том, что они могут обнаружиться и у совершенно здоровых людей. В этом случае показано проведение повторного исследования.
Норма анализа АНФ - титр не более 1:160. При этом данный показатель актуален как для взрослых, так и для детей.
Во время расшифровки АНФ-анализа крови важно учитывать следующую информацию:
Анализ АНФ, осуществленный с помощью клеток НЕр-2, считается нормальным, если титр не выше 1:160. Результат более 1:640 свидетельствует об обострении ревматических патологий. В период ремиссии заболевания титр снижается до 1:320. При этом только врач сможет выявить тот факт, о чем говорит такой низкий показатель, основываясь на данных анамнеза и индивидуальных особенностях здоровья пациента.
Связываясь с антигенами, образуют иммунный комплекс. Последний, в свою очередь, является пусковым фактором развития воспалительного процесса в стенках сосудов. В результате у человека появляются первые тревожные симптомы системных заболеваний. Анализ же показывает высокие титры.
В этом случае патологию можно выявить, определив тип свечения. Интерпретация результатов:
Уменьшение уровня антинуклеарных антител имеет клинически важное значение исключительно при прогнозировании и мониторинге имеющихся и ранее выявленных системных заболеваний.
Показатель АНФ напрямую зависит от интенсивности патологического процесса. В связи с этим его уменьшение - это благоприятный признак, свидетельствующий о том, что лечение было проведено успешно, а болезнь перешла в стадию ремиссии.
Каждая патология аутоиммунного характера требует определенного терапевтического подхода. Цель проведения исследования крови на АНФ - выявить в жидкой соединительной ткани антитела и оценить характер их взаимодействия со специфическими антигенами. На основании результатов диагностики врач может предварительно поставить диагноз. Для его подтверждения необходимо проведение дополнительных исследований. И только после этого врачом составляется схема лечения. Выбор медикаментозных средств напрямую зависит от того, какая патология выявлена у человека.
Сдать анализ АНФ можно в независимой лаборатории, частной клинике или государственном медицинском учреждении. Важно знать о том, что не во всех бюджетных поликлиниках подобная услуга предоставляется. Относительно ее наличия необходимо уточнять в регистратуре.
Исследование является платным даже в государственных медицинских учреждениях. Стоимость анализа напрямую зависит от ценовой политики клиники, складывающейся из множества факторов. Минимальная цена составляет 1000 рублей, максимальная не превышает 1700 рублей. Кроме того, необходимо дополнительно оплатить забор крови. Стоимость данной услуги, как правило, не превышает 200 рублей.
Аббревиатура АНФ расшифровывается как антинуклеарный фактор. В норме он не должен присутствовать в крови здорового человека или же его концентрация должна быть менее 1:160. Анализ на АНФ назначается для того, чтобы выявить у пациента патологии аутоиммунного характера на самой ранней стадии их развития.
Суть метода: при проникновении в организм провоцирующих агентов защитной системой начинают вырабатываться антитела. Их задача - атаковать антигены и уничтожить их. Для выявления данной реакции у пациента осуществляется забор венозной крови с последующим отделением сыворотки. В последнюю добавляют специфические антигены и оценивают дальнейшие реакции.
Системные ревматические заболевания
Антинуклеарный фактор (АНФ) и тип свечения
Определение антинуклеарного фактора (АНФ) представляет собой основной метод выявления антинуклеарных антител, который позволяет выявить большинство разновидностей антинуклеарных антител, включая аутоантитела к нуклеиновым кислотам (дсДНК, осДНК, РНК), конформационным и нерастворимым антигенам. Результатом определения АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре, конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию аутоантител, а также тип свечения ядра клетки (тест 01.02.15.005) . Характеристики конкретной методики зависят, прежде всего, от выбора субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий (Hep2, Kb, HeLa), а также метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность ряда ядерных антигенов АНА.
История разработки тестов для выявления антинуклеарных антител:
Начало ХХ века — «гиалиновые тельца» в цитоплазме лейкоцитов
1948 год Hargraves, Richmond, Morton — метод обнаружения LE-клеток invitro при длительной инкубации лейковзвеси больных СКВ
1951 год Lee, Michael, Vural — обнаружили сывороточный фактор, стимулирующий фагоцитоз ядер лимфоцитов лейкоцитами периферической крови
1957 год Holoborow, Weir, Johnsonиспользовали метод непрямой иммунофлюоресцнеции, разработанный Coons в 1950 для выявления АНФ на криосрезах печени человека
1961 год Beck — использовал ткани лабораторных животных
1982 год Tan — использовал перевиваемую клеточную линию человека HEp-2, этот тест стал золотым стандартом выявления АНА
1958 год Jones — обнаружил в крови больных синдромом Шегрена фактор, способный преципитировать экстракты ядер клеток, что послужило толчком для описания большинства разновидностей антинуклеарных антител
Непрямая иммунофлюоресценция на перевиваемой клеточной линии Нер2
Метода выявления АНФ был разработан Таном (Tan, 1982), применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2 (ATCC ref.no. CCL-23). Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле.
Рисунок: клетки клеточной линии НЕр-2, окрашенные гематологическим красителем.
Сравнительная неприхотливость этой линии, крупные ядра и присутствие всех человеческих антигенов сделало метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ. В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого метода, иногда этот метод для краткости обозначают как FANA(Fluorescent AntiNuclear Antibody detection). Отсутствие единства номенклатуры породило путаницу в названии лабораторных тестов. Иногда под термином «антинуклеарные антитела» иммунологические лаборатории называют тесты, как основанные на методах иммуноферментного и иммунохимическом анализе, так и метод иммунофлюоресценции. В русскоязычной литературы мы считаем необходимым сохранить отечественное название этого показателя - «антинуклеарный фактор» (АНФ), чтобы отличить иммунофлюресцентный метод от других тестов для обнаружения АНА.
Необходимо выявлять АНФ класса IgG, так как выявление АНФ, представленных другими классами иммуноглобулинов не имеет самостоятельного диагностического значения. Стандартные разведения сыворотки больного инкубируются с тканевым субстратом, что позволяет антинуклеарным антителам из сыворотки больного связаться с соответствующими ядерным мишенями. После этого места связывания аутоантител детектируются с помощью античеловеческой антисыворотки, меченной флюоресцеином.
Хотя в качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линий Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюоресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое, богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того, применение клеточной линии Hep-2 способствует обнаружению антител Ro/SS-A, а также антител к антигенам ядрышка, которые плохо при использовании криосрезов ткани лабораторных животных. Среди других преимуществ HEp-2 можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами.
Титры антинуклеарного фактора
Титр АНФ определяется как последнее разведение сыворотки больного, которое обладает четкой флюоресценцией ядер клеток. При использовании тканей лабораторных животных диагностический титр АНФ составляет 1:8-1:10, в то время как при использовании клеточной линии НЕр-2 рекомендуется использовать исходный титр 1:80. В этом случае в норме титры АНФ менее 1:160.
При использовании титров менее 1:160 частота слабоположительных результатов у клинически-здоровых лиц составит не более 5%, и в то же время не позволит пропустить значимые титры АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани.
Для определения конечного титра обычно используется титрование шагом х2 (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 и т.д. Может использоваться и более грубое титрование. На фоне обострения ревматических заболевания обычно отмечаются титры АНФ более 1:640, а при ремиссии титры снижаются до 1:160-1:320.
Существуют рекомендации по бальной оценке результатов выявления АНФ, указыващей содержание «в крестах». Это позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполение исследований. В этом случае определение конечного титра не представляется возможным. Необходимо учитывать, что конечный титр имеет более важное значение, по сравнению с количеством связавшихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью их взаимодействия с антигеном. Желательно определять конечный титр у всех положительных больных, что позволяет уточнять присутствие в сыворотке высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса.
Тип свечения ядра антинуклеарного фактора
Уже в первом опыте клинического применения непрямой иммунофлюоресценции для выявления АНФ с использованием криосрезов тканей лабораторных было отмечено, что сыворотка больных с аутоиммунными заболеваниями заболеваниями по разному «окрашивала» ядра клеток, что приводило к селективному свечению некоторых структур ядра. Уточнение этого феномена привел к описанию так называемых «типов свечения» ядра в иммунофлюоресцентном тесте. Это связано с тем, что каждая разновидность АНА имеет конкретные клеточные мишени, вследствие чего тип свечения ядра, ядрышка и цитоплазмы клетки отражает взаимодействие АНА сыворотки больного с антиген-содержащими структурами внутри клетки. Тип свечения зависит от присутствия конкретных аутоантител в сыворотке крови больного, на основе чего, можно сделать предварительное заключение относительно тех разновидностей АНА, которые имеются в данной сыворотке. Однако применение гистологических срезов тканей лабораторных животных не позволяет достоверно установить тип свечения. В то же время использование перевиваемых клеточных линий, таких как Нер-2 позволяет описать значительное количество вариантов окрашивания ядра и цитоплазмы. Существует три основные группы антигенов, присутствие антител к которым определяет различные типы свечения:
Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ, в связи с чем, должен рутинно определяться при определении этого показателя. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА, присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутоантител с антиген-содержащими структурами клетки.
Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы свечения ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого, а также набор антигенам, с которыми реагируют аутоантитела в сыворотках больных. Описание типов свечения представляет ценную клиническую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем.
При гомогенном типе свечения аутоантитела реагируют с теми антигенами, которые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина. Характерно, при обнаружении гомогенного типа свечения, в делящихся клетках ярко окрашиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами хроматина являются нуклеосомы - комплексы ДНК и гистонов. Таким образом, гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеросом, дсДНК и антител к гистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения указывает на диагноз СКВ.
Периферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного типа свечения. Его выявление является артефактом фиксации клеток, что приводит к перераспределению хроматина в ядре на периферию. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания ядерной мембраны, которое отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени. Периферический тип свечения обнаруживается у больных с антителами к двуспиральной ДНК и выявляется преимущественно у больных с СКВ.
Гранулярный тип является наиболее частым встречающимся и, одновременно, наиболее неспецифическим. Иногда этот тип свечения в отечественной литературе называют «крапчатым» или «сетчатым». Название «гранулярный» более точно отражает этот феномен, так как в этом случае аутоантитела реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопротеиновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют в ядре ряд функций, необходимых для нормального функционирования клетки. К таким комплексам, в частности, относятся сплайсосомы, которые осуществляют посттранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на рибосомах. В составе присутствут множество различных нуклеопротеинов, что обуславливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении гранулярного типа свечения. К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят к визуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA. Клетки в процесс деления утрачивают большинство сформированных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются. Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных при СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА и ряда других аутоиммунных заболеваниях. Низкие титры АНФ с гранулярным типом преобладает в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ без признаков системного заболевания.
Выявления очень высоких титров АНФ (1:2560-1:10000) с крупногранулярным типом свечения ядра обычно указывает на диагноз смешанного заболевания соединительной ткани и требует дообследования для выявления RNPантигена, который является основным серологическим маркером этого заболевания.
Антигены ядрышка могут выступать в качестве мишеней АНА, что приводит к обнаружению ядрышкового типа флюоресценции. Выявление ядрышкового типа свечения характерно для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как PHК полимераза 1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl.
Центромерный тип флюоресценции отмечается при появлении антител к центромерам хромосом, и обнаруживается только в делящихся клетках. Его присутствие характерно при CREST варианте склеродермии.
Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам, в частности Jo-1, которые отмечаются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям при первичном билиарном циррозе.
Можно охарактеризовать ряд других разновидностей свечения, причем эти типы окрашивания ядра клеток могут быть характерны для конкретной разновидности АНА. Так антитела к Scl-70 в иммунофлюоресцентном тесте на HEp-20 клетках дают мелкогранулярное окрашивание ядра и ядрышек, анти-р80 - светящиеся точки в ядре, которые отсутствуют в митотических клетках. Однако необходимо указать на редкость и разнообразие таких феноменов, что делает излишним их выявление при рутинных исследованиях.
Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях выявляется гомогенный или центромерный типы флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА. Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнительно низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что требует дальнейшего лабораторного обследования.
Обнаружение АНФ является основой для использования других лабораторных тестов, уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последущего обследования должен интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа свечения и титра АНФ.
Хотя отсутствие значимых титров АНФ практически всегда исключает диагноз активного системного ревматического заболевания, но при использовании клеточной линии НЕр-2, у 2-4% больных, удовлетворяющих критериям для диагноза СКВ, АНА не определяются или титры низки. Этих больных иногда относят к группе «АНФ-негативной СКВ », для уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде всего выявление антител к SS-Aантигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток. Для сокращения этой категории пациентов используется комплексное тестирование, включающее определение антител к экстрагируемым ядерным антигенам, так называемый «скрининг заболеваний соединительной ткани », тест 000723 . Отрицательный результат такого обследования позволяет с очень высокой вероятностью позволяет исключить диагноз СКВ и других системных ревматических заболевании.
Системные ревматические заболевания
Антинуклеарный фактор (АНФ) и тип свечения
Определение антинуклеарного фактора (АНФ) представляет собой основной метод выявления антинуклеарных антител, который позволяет выявить большинство разновидностей антинуклеарных антител, включая аутоантитела к нуклеиновым кислотам (дсДНК, осДНК, РНК), конформационным и нерастворимым антигенам. Результатом определения АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре, конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию аутоантител, а также тип свечения ядра клетки (тест 01.02.15.005) . Характеристики конкретной методики зависят, прежде всего, от выбора субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий (Hep2, Kb, HeLa), а также метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность ряда ядерных антигенов АНА.
История разработки тестов для выявления антинуклеарных антител:
Начало ХХ века — «гиалиновые тельца» в цитоплазме лейкоцитов
1948 год Hargraves, Richmond, Morton — метод обнаружения LE-клеток invitro при длительной инкубации лейковзвеси больных СКВ
1951 год Lee, Michael, Vural — обнаружили сывороточный фактор, стимулирующий фагоцитоз ядер лимфоцитов лейкоцитами периферической крови
1957 год Holoborow, Weir, Johnsonиспользовали метод непрямой иммунофлюоресцнеции, разработанный Coons в 1950 для выявления АНФ на криосрезах печени человека
1961 год Beck — использовал ткани лабораторных животных
1982 год Tan — использовал перевиваемую клеточную линию человека HEp-2, этот тест стал золотым стандартом выявления АНА
1958 год Jones — обнаружил в крови больных синдромом Шегрена фактор, способный преципитировать экстракты ядер клеток, что послужило толчком для описания большинства разновидностей антинуклеарных антител
Непрямая иммунофлюоресценция на перевиваемой клеточной линии Нер2
Метода выявления АНФ был разработан Таном (Tan, 1982), применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2 (ATCC ref.no. CCL-23). Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле.
Рисунок: клетки клеточной линии НЕр-2, окрашенные гематологическим красителем.
Сравнительная неприхотливость этой линии, крупные ядра и присутствие всех человеческих антигенов сделало метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ. В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого метода, иногда этот метод для краткости обозначают как FANA(Fluorescent AntiNuclear Antibody detection). Отсутствие единства номенклатуры породило путаницу в названии лабораторных тестов. Иногда под термином «антинуклеарные антитела» иммунологические лаборатории называют тесты, как основанные на методах иммуноферментного и иммунохимическом анализе, так и метод иммунофлюоресценции. В русскоязычной литературы мы считаем необходимым сохранить отечественное название этого показателя - «антинуклеарный фактор» (АНФ), чтобы отличить иммунофлюресцентный метод от других тестов для обнаружения АНА.
Необходимо выявлять АНФ класса IgG, так как выявление АНФ, представленных другими классами иммуноглобулинов не имеет самостоятельного диагностического значения. Стандартные разведения сыворотки больного инкубируются с тканевым субстратом, что позволяет антинуклеарным антителам из сыворотки больного связаться с соответствующими ядерным мишенями. После этого места связывания аутоантител детектируются с помощью античеловеческой антисыворотки, меченной флюоресцеином.
Хотя в качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линий Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюоресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое, богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того, применение клеточной линии Hep-2 способствует обнаружению антител Ro/SS-A, а также антител к антигенам ядрышка, которые плохо при использовании криосрезов ткани лабораторных животных. Среди других преимуществ HEp-2 можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами.
Титры антинуклеарного фактора
Титр АНФ определяется как последнее разведение сыворотки больного, которое обладает четкой флюоресценцией ядер клеток. При использовании тканей лабораторных животных диагностический титр АНФ составляет 1:8-1:10, в то время как при использовании клеточной линии НЕр-2 рекомендуется использовать исходный титр 1:80. В этом случае в норме титры АНФ менее 1:160.
При использовании титров менее 1:160 частота слабоположительных результатов у клинически-здоровых лиц составит не более 5%, и в то же время не позволит пропустить значимые титры АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани.
Для определения конечного титра обычно используется титрование шагом х2 (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 и т.д. Может использоваться и более грубое титрование. На фоне обострения ревматических заболевания обычно отмечаются титры АНФ более 1:640, а при ремиссии титры снижаются до 1:160-1:320.
Существуют рекомендации по бальной оценке результатов выявления АНФ, указыващей содержание «в крестах». Это позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполение исследований. В этом случае определение конечного титра не представляется возможным. Необходимо учитывать, что конечный титр имеет более важное значение, по сравнению с количеством связавшихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью их взаимодействия с антигеном. Желательно определять конечный титр у всех положительных больных, что позволяет уточнять присутствие в сыворотке высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса.
Тип свечения ядра антинуклеарного фактора
Уже в первом опыте клинического применения непрямой иммунофлюоресценции для выявления АНФ с использованием криосрезов тканей лабораторных было отмечено, что сыворотка больных с аутоиммунными заболеваниями заболеваниями по разному «окрашивала» ядра клеток, что приводило к селективному свечению некоторых структур ядра. Уточнение этого феномена привел к описанию так называемых «типов свечения» ядра в иммунофлюоресцентном тесте. Это связано с тем, что каждая разновидность АНА имеет конкретные клеточные мишени, вследствие чего тип свечения ядра, ядрышка и цитоплазмы клетки отражает взаимодействие АНА сыворотки больного с антиген-содержащими структурами внутри клетки. Тип свечения зависит от присутствия конкретных аутоантител в сыворотке крови больного, на основе чего, можно сделать предварительное заключение относительно тех разновидностей АНА, которые имеются в данной сыворотке. Однако применение гистологических срезов тканей лабораторных животных не позволяет достоверно установить тип свечения. В то же время использование перевиваемых клеточных линий, таких как Нер-2 позволяет описать значительное количество вариантов окрашивания ядра и цитоплазмы. Существует три основные группы антигенов, присутствие антител к которым определяет различные типы свечения:
Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ, в связи с чем, должен рутинно определяться при определении этого показателя. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА, присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутоантител с антиген-содержащими структурами клетки.
Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы свечения ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого, а также набор антигенам, с которыми реагируют аутоантитела в сыворотках больных. Описание типов свечения представляет ценную клиническую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем.
При гомогенном типе свечения аутоантитела реагируют с теми антигенами, которые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина. Характерно, при обнаружении гомогенного типа свечения, в делящихся клетках ярко окрашиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами хроматина являются нуклеосомы - комплексы ДНК и гистонов. Таким образом, гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеросом, дсДНК и антител к гистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения указывает на диагноз СКВ.
Периферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного типа свечения. Его выявление является артефактом фиксации клеток, что приводит к перераспределению хроматина в ядре на периферию. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания ядерной мембраны, которое отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени. Периферический тип свечения обнаруживается у больных с антителами к двуспиральной ДНК и выявляется преимущественно у больных с СКВ.
Гранулярный тип является наиболее частым встречающимся и, одновременно, наиболее неспецифическим. Иногда этот тип свечения в отечественной литературе называют «крапчатым» или «сетчатым». Название «гранулярный» более точно отражает этот феномен, так как в этом случае аутоантитела реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопротеиновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют в ядре ряд функций, необходимых для нормального функционирования клетки. К таким комплексам, в частности, относятся сплайсосомы, которые осуществляют посттранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на рибосомах. В составе присутствут множество различных нуклеопротеинов, что обуславливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении гранулярного типа свечения. К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят к визуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA. Клетки в процесс деления утрачивают большинство сформированных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются. Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных при СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА и ряда других аутоиммунных заболеваниях. Низкие титры АНФ с гранулярным типом преобладает в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ без признаков системного заболевания.
Выявления очень высоких титров АНФ (1:2560-1:10000) с крупногранулярным типом свечения ядра обычно указывает на диагноз смешанного заболевания соединительной ткани и требует дообследования для выявления RNPантигена, который является основным серологическим маркером этого заболевания.
Антигены ядрышка могут выступать в качестве мишеней АНА, что приводит к обнаружению ядрышкового типа флюоресценции. Выявление ядрышкового типа свечения характерно для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как PHК полимераза 1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl.
Центромерный тип флюоресценции отмечается при появлении антител к центромерам хромосом, и обнаруживается только в делящихся клетках. Его присутствие характерно при CREST варианте склеродермии.
Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам, в частности Jo-1, которые отмечаются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям при первичном билиарном циррозе.
Можно охарактеризовать ряд других разновидностей свечения, причем эти типы окрашивания ядра клеток могут быть характерны для конкретной разновидности АНА. Так антитела к Scl-70 в иммунофлюоресцентном тесте на HEp-20 клетках дают мелкогранулярное окрашивание ядра и ядрышек, анти-р80 - светящиеся точки в ядре, которые отсутствуют в митотических клетках. Однако необходимо указать на редкость и разнообразие таких феноменов, что делает излишним их выявление при рутинных исследованиях.
Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях выявляется гомогенный или центромерный типы флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА. Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнительно низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что требует дальнейшего лабораторного обследования.
Обнаружение АНФ является основой для использования других лабораторных тестов, уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последущего обследования должен интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа свечения и титра АНФ.
Хотя отсутствие значимых титров АНФ практически всегда исключает диагноз активного системного ревматического заболевания, но при использовании клеточной линии НЕр-2, у 2-4% больных, удовлетворяющих критериям для диагноза СКВ, АНА не определяются или титры низки. Этих больных иногда относят к группе «АНФ-негативной СКВ », для уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде всего выявление антител к SS-Aантигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток. Для сокращения этой категории пациентов используется комплексное тестирование, включающее определение антител к экстрагируемым ядерным антигенам, так называемый «скрининг заболеваний соединительной ткани », тест 000723 . Отрицательный результат такого обследования позволяет с очень высокой вероятностью позволяет исключить диагноз СКВ и других системных ревматических заболевании.
