Фазово-контрастный микроскоп значительно повышает контрастность объектов, проницаемых для света, и в медицине используется для изучения нативных препаратов. С помощью этого метода могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты, детали, строение которых оптически мало различаются между собой.
Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей интенсивности, т.е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются “амплитудными”. Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей интенсивности. Амплитуда световой волны не изменяется, а лишь изменяется фаза колебания, что не регистрируется человеческим глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним относятся живые, неокрашенные препараты. Чтобы повысить контрастность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного контраста.
Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения светового потока через объект по сравнению со скоростью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель светопреломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называемые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза колебаний прошедшего света, характерны для большинства биологических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).
Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитудные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми.
Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим образом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светопольному конденсору. Затем, поместив на предметный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании методом фазового контраста основным условием является оптимальная освещенность, которая достигается установкой света по Келеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе ´40 в окошечке также устанавливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (кольцевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центровочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно производить исследование препарата.
Метод аноптрального контраста является усовершенствованием метода фазового контраста. Теоретические обоснования и конструктивные особенности аноптрального устройства, в основном не отличаются от обычной фазово-контрастной установки (рис. 6). Принцип его устройства заключается в следующем. На верхнюю поверхность предпоследней линзы иммерсионного объектива наносится кольцо из сажи, пропускающей лишь около 10% проходящего света. В передней фокальной плоскости конденсора помещается кольцевая диафрагма, изображение которой должно полностью совпадать с кольцом сажи на объективе. Препарат освещается полным конусом лучей, проходящих через кольцевую диафрагму конденсора. При отсутствии объектов (например, микробов в препарате) в объектив попадают только недифрагированные лучи, амплитуда которых, после того как они пройдут через кольцо сажи, уменьшится на 90%. В то же время амплитуда лучей, дифрагированных частицами объекта, которые пройдут мимо кольца из сажи, не изменится и поэтому фон поля будет темный, а частицы объекта светлыми. Преимуществом метода аноптральной микроскопии является большая разрешающая способность объективов и возможность выявления минимальных оптических разностей плотности в неокрашенных препаратах. Чем больше оптическая плотность объекта, тем светлее его изображение. Методика использования устройства не отличается от фазово-контрастного. При помощи аноптрального микроскопа можно изучать морфологию и локализацию нуклеоидов (ядерный аппарат), наблюдать за изменениями морфологии бактерий в процессе нормального роста и размножения.
Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В12, алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией. Клетки микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными красителями - флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500 -1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку.
Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля). При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если в исследуемом препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие объекты. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа.
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Фазово-контрастная микроскопия ценна прежде всего тем, что с ее помощью можно наблюдать живые объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. С точки зрения увеличения изображения объекта, никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа. При отсутствии специального микроскопа обычный световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые изменения световых волн, проходящих через объект в амплитудные. В результате этого живые прозрачные объекты становятся контрастными и видными в поле зрения.
С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д.
основанную на превращении невидимых фазовых изменений световых волн, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Электронная микроскопия . Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно¬сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
Обычный просвечивающий электронный микроскоп похож на световой, за тем исключением, что объект облучается не световым потоком, а пучком электронов, генерируемым специальным электронным прожектором. Полученное изображение проецируется на люминесцентный экран с помощью системы линз. Увеличение просвечивающего электронного микроскопа может достигать миллиона, однако, для атомно-силовых микроскопов и это не предел.
ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света объектов, основанный на усилении контраста изображения.
Прозрачные, не окрашенные объекты (живые и фиксированные микроорганизмы, клетки и др.), отличающиеся от окружающей среды по показателю преломления, не поглощают света, но изменяют его скорость и, следовательно, фазу световых колебаний. Причем степень этих изменений зависит от величины показателя преломления и толщины структур объекта. Однако эти изменения не воспринимаются глазом, не регистрируются фотоматериалами, и исследуемые объекты при световой микроскопии почти не отличаются от фона. Для усиления контрастности изображения применяют фазово-контрастная микроскопия. Ее широко используют для прижизненного изучения микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных. В гематологии, например, фазово-контрастную микроскопию применяют для подсчета и дифференциации клеток, изучения их подвижности, дифференциальной диагностики лейкозов и др.
Способ превращения фазовых изменений в соответствующие им амплитудные был предложен в 30-х годов 20 века голландским физиком Зернике (F. Zernike). Принцип фазово-контрастной микроскопии заключается в том, что свет, не отклоненный объектом, проходит через нанесенное на одну из линз объектива фазовое кольцо, смещающее его фазу на четверть длины волны и ослабляющее его интенсивность (для того, чтобы уравнять ее с интенсивностью дифрагированного объектом света), а дифрагированный (отклоненный) свет проходит мимо фазового кольца (см. Микроскоп).
Прохождение прямого, не дифрагированного объектом света через фазовое кольцо обеспечивается находящейся в конденсоре кольцевой диафрагмой, проекция к-рой в плоскости выходного зрачка объектива равна по диаметру и ширине фазовому кольцу и должна полностью совпадать с ним. Для каждого объектива имеется своя кольцевая диафрагма.
В плоскости изображения происходит интерференция световых волн, прошедших и не прошедших через фазовое кольцо. При этом возникают различия в амплитуде, отражающие изменения фазы в зависимости от свойств участков объекта. В отличие от фазовых амплитудные изменения световых волн хорошо видны глазом и могут быть зарегистрированы.
В зависимости от способа изготовления фазового кольца фаза прямого, не дифрагированного объектом света может либо опережать фазу дифрагированного, либо отставать от нее. При этом возникает или наиболее распространенный позитивный фазовый контраст, где частицы с показателем преломления большим, чем у окружающей среды (более плотные), выглядят темными на светлом фоне, или негативный, где такие же частицы дают изображение светлее окружающего фона. Необходимо, однако, отметить, что эта картина сохраняется только до определенной величины показателя преломления, а после достижения этой величины происходит инверсия контраста, то есть наблюдаются обратные закономерности.
Фазово-контрастное устройство (в частности, КФ-4, выпускаемое в нашей стране) состоит из объективов, на одну из линз которых нанесено фазовое кольцо, конденсора с револьверным диском, содержащим набор кольцевых диафрагм, и центрировочным приспособлением, а также вспомогательного микроскопа (рис. 1), с помощью которого в плоскости выходного зрачка объектива можно наблюдать за совмещением фазового кольца и проекции кольцевой диафрагмы конденсора. Это устройство может быть установлено на любой микроскоп.
Существует ряд конструктивных разновидностей фазово-контрастных устройств: с одной кольцевой диафрагмой для всех объективов при использовании панкратического конденсора (например, в отечественных микроскопах МБИ-6, МБИ-15), с так называемым вынесенным зрачком, при котором фазовое кольцо помещается вне объектива, что позволяет использовать для фазово-контрастной микроскопии обычные объективы (такое устройство имеется в отечественных микроскопах МБИ-13, МБИ-17). Выпускаются также устройства с переменным фазовым контрастом (с двумя кольцами разного диаметра).
Одной из разновидностей негативного фазового контраста является аноптральное (фазово-темнопольное) устройство. Аноптральное устройство было создано в 1953 году Вильской (A. Wilska) и используется для изучения объектов, вносящих небольшой сдвиг фазы. Модификация этого метода была предложена М. А. Пешковым и широко использовалась у нас в стране.
Методика приготовления препаратов для фазово-контрастной микроскопии зависит от объекта исследования и длительности его изучения: неокрашенные микроорганизмы можно рассматривать в препаратах раздавленная капля (см.), для длительного наблюдения и кинорегистрации размножения микроорганизмов используют специальные агаровые.микрокамеры (см.) на предметных стеклах (камера Фонбрюна, HI-образная камера Пешкова). Для изучения динамики процессов в однослойных культурах ткани также применяют микрокамеры (стационарные и перфузионные). Очень важными факторами, в значительной мере определяющими качество изображения, являются толщина препарата и различия в показателях преломления объекта и среды.
Техника фазово-контрастной микроскопии сравнительно проста: объективы и конденсор микроскопа заменяют на специальные (на отечественных фазово-контрастных объективах имеется обозначение Ф, на зарубежных - Ph), диск конденсора устанавливают в положение О (то есть сквозное отверстие без кольцевой диафрагмы), на предметный столик помещают препарат, настраивают свет по Келеру (см. Микроскопические методы исследования), вращением диска вводят кольцевую диафрагму, соответствующую увеличению объектива. Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Выдвигая его верхнюю часть, получают резкое изображение фазового кольца и кольцевой диафрагмы. Центрировочными винтами конденсора точно совмещают оба кольца, после чего вместо вспомогательного микроскопа устанавливают окуляр. При смене препарата целесообразно проверить совмещение колец (рис. 2).
Достоинством фазово-контрастной микроскопии является возможность проводить прижизненные наблюдения (без какой-либо обработки) биол. объектов, напр, макрофагов (рис. 3), а недостатком - возникновение светлого (в случае позитивного контраста) или темного (в случае негативного) ореола вокруг объекта и его структур. Более полная информация может быть получена при сочетании фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии при применении как иммунолю-минесцентного (см. Иммунофлюоресценция), так и люминесцентно-цитохимического метода (см. Люминесцентная микроскопия). При работе с люминесцирующими сыворотками фазово-контрастной микроскопии позволяет убедиться в наличии микрообъекта в том случае, если он не связывает люминесцирующие антитела, а также изучать объекты, у которых антитела фиксируются на отдельных структурах.
Особенно большую роль в прижизненном цитологическом изучении динамики различных физиологических и патологических процессов в клеточной биологии, микробиологии, вирусологии сыграло сочетание фазово-контрастной и аноптральной микроскопии с микрокиносъемкой (см.). Этот метод был использован для изучения цитологии бактерий и простейших, митоза в различных клетках, цитопатического действия вирусов и риккетсий на клетки. Были также изучены особенности образования и развития L-форм бактерий и микоплазм, действие антибиотиков на бактерии.
Библиогр.: Кравченко А. Т., Милютин В. Н. и Гудима О. С. Микрокиносъемка в биологии, М., 1963; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 5, 25, М., 1973; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969; Франсон М. Фазовоконтрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М., 1960; Cinemic-rography in cell biology, ed. by G. G. Rose, N. Y.-L., 1963; Zernike F. Diff-raktion theory of the knife edge test and its improved form of the phase contrast method, Physica, v. 1, p. 689, 1934.
М. Я. Корн, E. С. Станиславский.
Схема фазово-контрастного микроскопа.
1. Кольцо конденсора
2. Предметная плоскость
3. Фазовое кольцо
4. Первичное изображение.
P - фазовая пластинка.
В отличие от опорного света, рассеянный на образце предметный свет, в областях, изображённых синим, минует фазовую пластинку, таким образом длина его оптического пути другая.
Фазово-контрастная микроскопия - метод получения изображений в оптических микроскопах , при котором сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Используется для получения изображений прозрачных объектов. Фазово-контрастную микроскопию изобрёл Фриц Цернике , за что получил Нобелевскую премию за 1953 год .
Для получения фазовоконтрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути . Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.
Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки , расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.
Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки , из-за которого та может погибнуть.
Голландский физик, математик и химик Фриц Цернике в 1930 году начал работать в области оптики. В этом же году он открыл фазово-контрастный метод. В течение 1930-1940-х годов Цернике внёс свой вклад и в других вопросах оптики, в то время как фазово-контрастный метод не был замечен широкими кругами учёных. Новый метод оставался вне поля зрения научного сообщества вплоть до Второй мировой войны , когда во время немецкой оккупации Голландии открытие Цернике было использовано для создания первых фазово-контрастных микроскопов. В течение войны многие производители стали выпускать фазово-контрастные микроскопы, и они стали широко применяться в биологических и медицинских исследованиях.
Вы можете помочь проекту, расширив текущую статью с помощью перевода. |
Многие из нас не любят лечиться и тем более обращаться к врачам. Насморк, боль в горле, кашель - как часто мы не придаем значения этим симптомам! А между тем банальный кашель, вызванный раздражением слизистой, при благоприятных условиях превращается в воспаление бронхов. И его уж точно нужно лечить. Причем самые излюбленные лекарства отечественных врачей - антибиотики - при бронхите показаны далеко не всегда. Но к сожалению, многие больные и что еще печальней, некоторые врачи или игнорируют эту информацию, или вовсе ею не владеют.
Попробуем постепенно разобраться, что же такое бронхит, и почему антибактериальные средства не панацея от этой болезни. А заодно и выяснить, когда и какие антибиотики показаны при бронхите.
Итак, бронхитом принято называть воспаление бронхов - дыхательных путей, простирающихся от трахеи. На уровне четвертого и пятого позвонков трахея разделяется на два главных бронха, которые дополнительно разветвляются на целую сеть более мелких бронхов и бронхиол. Визуально такая картина очень напоминает дерево, что и отразилось в названии всей сложной бронхиальной системы.
Острый бронхит проявляется кашлем, длящимся меньше трех недель. Именно длительность и тяжесть кашля, сопровождающего воспалительный процесс, становится главной причиной, по которой врачи не могут удержаться от назначения антибиотиков при остром бронхите.
Острый бронхит - пятая причина обращения взрослых за медицинской помощью. Заболевание настигает 44 человека из 1000, причем в 82% случаев это происходит в осенне-зимний период. По приблизительным оценкам у 4% пациентов острый бронхит переходит в хроническую форму. Специалисты говорят, что эти и так весьма красноречивые цифры не полностью отражают действительность. Множество больных, страдающих бронхитом, предпочитают кашлять дома, обрекая свои дыхательные пути на длительное воспаление, которое может вылиться в пневмонию.
Хронический бронхит - это кашель, сопровождающийся мокротой и продолжающийся три месяца и дольше . В процессе хронического бронхита происходят серьезные изменения в строении слизистой бронхов. Постепенно запущенное заболевание переходит в самую опасную стадию, обструктивную, которая доставляет еще больше неприятностей. Однако хронический бронхит чаще всего вызван неблагоприятными условиями окружающей среды и курением, и антибиотики абсолютно не показаны при этой патологии. Поэтому мы сегодня будем в основном говорить об остром бронхите у детей и взрослых.
И начнем с того, что острый бронхит нужно лечить… правильно. И вот тут-то многих врачей и пациентов подстерегают тонкости и сложности. Разобраться с ними поможет информация о возбудителях заболевания.
>>Рекомендуем: если вы интересуетесь действенными методами избавления от хронического насморка, фарингита, тонзиллита, бронхита и постоянных простуд, то обязательно загляните на эту страницу сайта после прочтения данной статьи. Информация основана на личном опыте автора и помогла многим людям, надеемся, поможет и вам. Сейчас возвращаемся к статье.<<
Самой распространенной причиной острого бронхита являются банальные респираторные вирусы. К числу «популярных» микроорганизмов относятся вирусы гриппа А и В, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирус.
Гораздо реже острый бронхит развивается в результате бактериальной инфекции. Среди микробов, чаще всего поражающих бронхиальное дерево, микоплазмы, хламидии Chlamydia pneumoniae, моракселлы, пневмококк (Streptococcus pneumoniae). Только в случае бактериальной инфекции лечение антибиотиками будет эффективным при бронхите.
Нельзя не упомянуть и о растущих в родительской среде настроениях против вакцинации. Вследствие большого количества детей, которые не были своевременно привиты против коклюша, к числу причин острого бронхита все чаще относится инфицирование Bordetella pertussis, возбудителем коклюша.
Наряду с самым распространенным проявлением болезни - кашлем - при остром бронхите могут быть:
Добавим, что об остром бронхите говорит кашель длительностью от пяти дней. Густая мокрота самых разных оттенков - один из важных признаков заболевания. Острый бронхит, как правило, протекает в течение трех недель, а в тяжелых случаях затягивается до двух месяцев.
Терапия острого бронхита в первую очередь нацелена на облегчение симптомов. Препаратами первой линии являются муколитики и отхаркивающие средства , которые помогают эффективно вывести мокроту. Достаточное количество кислорода, необходимое больным, обеспечивается путем регулярного проветривания помещения. Не менее важно контролировать и влажность воздуха. Сухой воздух зимних квартир способствует проникновению инфекции в нижние отделы дыхательных путей и развитию грозного осложнения - пневмонии.
При кашле, сопровождающемся одышкой и затруднением дыхания, назначают бронхолитики, например, Сальбутамол.
Таким образом, стандартное лечение острого бронхита вовсе не подразумевает применение антибиотиков. Когда же принято отклоняться от исключительно симптоматической схемы терапии?
Данных о целесообразности назначения антибактериальных препаратов при остром бронхите у взрослых людей с нормальным иммунным ответом очень немного. Как подтверждает практика, применение антибиотиков существенно не влияет на симптомы воспаления бронхов. А между тем побочные эффекты не самых безопасных препаратов развиваются независимо от того, насколько они эффективны.
Статистка приводит пугающие цифры: примерно 65–80% пациентов с острым бронхитом все-таки получают антибиотики, при этом положительные результаты лечения наблюдаются в единичных случаях. Почему же антибактериальные препараты почти не работают при остром бронхите?
Давайте вспомним информацию о возбудителях: в подавляющем большинстве случаев заболевание вызывают вирусы. А ведь антибиотики совершенно неэффективны при вирусной инфекции. Единичные случаи бактериального заражения, которое оказывается причиной острого бронхита, и дают в среднестатистической выборке данные о положительном действии антибактериальных средств.
Последние рекомендации ведущих мировых специалистов в пульмонологии, врачей из Национального института здравоохранения Великобритании, расставляют точки над i. В них говорится о том, что лечение острого бронхита антибиотиками не рекомендуется, за исключением случаев риска серьезных осложнений. Обычно такая вероятность существует у взрослых пациентов с сопутствующими заболеваниями.
Итак, попробуем перечислить ситуации, когда назначение антибиотиков при остром бронхите не только оправдано, но и единственно верно:
Дети болеют острым бронхитом гораздо чаще взрослых. Существует два возрастных пика среди заболевших воспалением бронхов: первые два года жизни и 9–15 лет. Именно в этом возрасте вероятность заболеть острым бронхитом наиболее высока. По статистике около 20–28% детей в течение года подстерегает кашель, который приводит к воспалению бронхов.
