Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.
Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.
Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента.
В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).
^
4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы
солода по методу Вольгемута»
Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.
Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.
^ Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.
Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.
^ Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.
Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.
Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки
(А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).
Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.
^ 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы
по Баху»
Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO 4 . Реакция протекает по уравнению
1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.
^ Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H 2 SO 4 ; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4); 0,1 моль/л раствор KMnO 4 .
Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.
^ Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H 2 SO 4 , затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H 2 SO 4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO 4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.
Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:
,
Где 
– разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO 4 , мл;
Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее
1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO 4 .
^
4.3 Лабораторная работа «Капельный метод
(по Климовскому и Родзевич)»
Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.
За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см 3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см 3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.
Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.
Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.
^ Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см 3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см 3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см 3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см 3 . Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.
Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.
^ Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.
Субстрат в количестве 25 см 3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см 3 (15 мл) вытяжки и 30 см 3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение
10 минут.
Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см 3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см 3 . Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см 3 , а воду вообще не добавлять.
Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.
Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до
20 минут.
Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.
Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см 3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см 3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см 3 , внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).
Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:
Где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см 3 1 %-ного раствора, г;
60 – коэффициент пересчета на 1 ч;
N – количество фермента, участвующего в реакции, г или см 3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);
T – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.
Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см 3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см 3 доведено в мерной колбе до 50 см 3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см 3 , т.е. получена такая последовательность разведения:
5 г → 100 см 3 → 20 см 3 → 50 см 3 → 2 см 3 .
Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см 3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см 3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:
При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:
,
Где W – влажность культуры или препарата.
^
4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера
и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической
активности ферментов в модификации»
Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.
Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см 3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС.
За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.
^ Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.
Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.
Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см 3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см 3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см 3 , к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см 3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.
Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.
^ Ход работы. К 10 см 3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см 3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см 3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см 3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.
Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:
,
Где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;
T – продолжительность протеолиза, ч;
Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см 3 жидкого ферментного раствора.
Величину А рассчитывают по формуле:
,
Где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см 3 опытной пробы, см 3 ;
А к – то же для контрольной пробы;
1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;
К – поправка к титру щелочи.
(По А.Н. Баху и А.И. Опарину)
Все разнообразные превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются специфическими белками.
Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и при сравнительно низкой температура тела. Биологическое значение этого явления очень велико.
Для изучения действия ферментов необходимо выделить их из живых тканей. Обычно для этой цели подбирают легко доступный источник, богатый данным ферментом. Для того, чтобы перевести фермент в раствор, необходимо разрушить клеточные оболочки, что достигается с помощью гомогенизатора, растирания в ступке с пестиком, замораживания и оттаивания, автолиза и др. Обычно, разрушение клеточных оболочек производят при низкой температуре, благодаря чему приостанавливаются все ферментативные процессы в тканях.
К группе окислительно-восстановительных ферментов относится гемсодержащий ферменткаталаза , которая катализирует реакцию разложения перекиси водорода с освобождением молекулярного кислорода:
2 Н 2 О 2 --> 2 Н 2 О + О 2
Каталаза находится в большинстве тканей живого организма.
Принцип метода.
Перекись водорода разлагается каталазой. Избыток перекиси водорода титруют перманганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:
2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 --> 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2
В опыте определяют количество оставшейся неразрушенной перекиси водорода, в контроле - общее количество взятой перекиси водорода (каталаза в контрольной пробе инактивирована кипячением).
Вычитая результаты опыта из результатов контроля, узнают количество разрушенной в определенный промежуток времени перекиси водорода, что позволяет судить об активности каталазы.
Оборудование: 1. Бюретки прямые на 50 и 100 мл (по 1 шт.)
2. Цилиндр на 10 мл
3. Ступка с пестиком
4. Конические колбы на 200-250 мл (2 шт.)
5. Технические весы с разновесами
6. Пипетка на 10 мл "вытяжка фермента"
7. Пипетка "H 2 SO 4 "
8. Кипящая водяная баня
9. Шпатель
10. Колба мерная на 100 мл
11. Воронка
12. Фильтровальная бумага
Материалы: 1. Свежий растительный материал (морковь или картофель)
2. 0.1н раствор Н 2 О 2
3. 0.1н раствор KMnO4
4. 10%-ный раствор H 2 SO 4
5. СаСО 3 (крист.)
6. Песок кварцевый
Ход работы:
2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют.
В коническую колбу на 200 мл берут из бюретки 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0.1н раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшейся перекиси водорода.
Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл) К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0.1н раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества перекиси водорода.
По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной перекиси водорода. Согласно уравнению реакции между KMnO 4 и H 2 O 2 , 1 мл 0.1н раствора перманганата калия соответствует 1.7 мг перекиси водорода.
Пример расчета.
Из 1.25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл. На титрование опытной пробы затрачено 15.5 мл,контрольной-30.2 мл 0.1н раствора перманганата калия. Количество разложенной перекиси водорода в пробе эквивалентно 30.2-15.5=14.7 мл 0.1н раствора перманганата калия и, следовательно, равно 14.7*1.7=24.99 мг.
В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 мг перекиси водорода, а за 1 мин - 99.96/30=3.33 мг. Так как
1 мкмоль перекиси водорода составляет 0.034 мг, то в 1 г моркови присутствует 33.3/0.034=100 Е каталазы.
Лабораторная работа №4
Получение сахаразы из дрожжевых клеток. Специфичность действия ферментов.
Все разнообразные химические превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются с п е ц и ф и ч е с к и м и б е л к а м и.
Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и сравнительно при низкой температуре тела.
Изучение свойств ферментов, условий их действия, определение содержания ферментов в различных органах и тканях имеет большое значение для правильного понимания сложнейших процессов жизнедеятельности организма.
Одним из важнейших свойств ферментов является специфичность их действия в отношении определенного субстрата. Специфичность каталитических свойств ферментов проявляется в том, что фермент, как правило, действует лишь на определенное вещество. На строгую специфичность ферментов указывает и тот факт, что в случаях стереоизомерии определенный фермент катализирует расщепление только одного стереоизомера. Специфичность ферментов - их важнейшее биологическое свойство, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ.
В данной работе рассматриваются процессы расщепления ферментом сахаразой субстрата - сахарозы и расщепления крахмала ферментом - амилазой, которая содержится в слюне человека.
Экстракция сахаразы из дрожжевых клеток
Материалы и реактивы:
· Прессованные дрожжи– 10 г
· Гомогенизатор (ступка с пестиком)
· Кварцевый песок
· Вода дистиллированная
Ход работы
10 грамм сухих дрожжей поместить в ступку, добавить 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировать в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка для разрушения клеточных стенок. Затем фарфоровую ступку с гомогенизатом поместить в сушильный шкаф с температурой 60 0 Сна 30-40 минут.
По истечении указанного времени вынуть ступку, охладить, добавить 30 мл дистиллированной воды и растереть содержимое ступки до однородной массы.
Затем гомогенизат, для осаждения клеточной массы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная надосадочная жидкость – экстракт сахаразы.
(по А.Н. Баху и А.И. Опарину)
Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.
Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.
Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД + , НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н 2 О 2 (пероксид водорода).
Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).
Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2 .
Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н 2 О 2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н 2 О 2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов на Н 2 О 2 , восстанавливая его до 2 Н 2 О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.
Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H 2 O 2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:
5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O
На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.
ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO 3 до прекращения выделения пузырьков СО 2 . В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.
Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H 2 O 2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.
Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:
где Х – активность каталазы, Е/г;
(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;
Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;
50 – коэффициент пересчета на мкмоль H 2 O 2 ;
100 – общий объем приготовленного экстракта;
m – масса взятого для анализа материала, г;
20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;
30 – время инкубации, мин.
Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.
Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H 2 O 2 .
Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.
1. Основные пути окисления субстратов в клетке.
2. Характеристика строения и действия НАД + - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.
3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.
4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.
5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.
6. Характеристика строения и действия цитохромов.
7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.
8. Метод определения активности каталазы.
Лабораторная работа № 1
РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ В УСКОРЕНИИ РЕАКЦИИ В КЛЕТКЕ
(ВЫЯВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ)
Цель: обнаружить действие фермента каталазы в растительных и животных клетках, сравнить ферментативную активность натуральных и повреждённых кипячением клеток.
Оборудование : 3%-ный раствор перекиси водорода, кусочки сырых и отварных картофеля и мяса (печени, лёгких), пробирки.
Выявление активности каталазы
Каталаза – это фермент, катализирующий разложение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа:
каталаза
2 H 2 O 2 _ → 2H 2 O + O 2
Пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта окислительно-восстановительных реакций. Соединение это токсично для клеток, и каталаза обеспечивает эффективное его удаление. Каталаза – один из наиболее быстро работающих ферментов: одна молекула каталазы разлагает в одну секунду до 200 000 молекул пероксида водорода. Локализуется каталаза в мембранных пузырьках клеток – микротельцах и пероксисомах.
Ход работы
Возьмите 4 чистые пробирки и поместите в первую из них небольшое количество мелко натёртого картофеля, во вторую – немного отварного картофеля, в третью – мелко измельчённые кусочки мяса (печени, лёгкого), в четвёртую – немного измельчённого отварного мяса. В каждую пробирку добавьте по 3-4 мл. 3%-ного раствора перекиси водорода. Пронаблюдайте, что происходит в пробирках. Результаты наблюдения занесите в таблицу.
Ферментативная активность натуральных и повреждённых клеток
| Объект | Явления, наблюдаемые в пробирке | Объяснение наблюдений |
| Сырой картофель | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Отварной картофель | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Сырое мясо | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
| Отварное мясо | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ | _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ |
Объясните полученные результаты. Сделайте вывод о каталитической активности каталазы в живых и мёртвых клетках.
Вывод: ________
_______________
_______________
_____________
Контрольные вопросы:
1. Что такое ферменты? Какой структурой белков создаётся их активность?___________
2. Какими свойствами обладают ферменты?______
3. Что называется активным центром фермента? Сколько таких центров может быть в ферменте?_
4. За счёт чего ферменты ускоряют химические реакции?___________________________
5. *Спирт, фенол, хлорамин и другие антисептики используются в медицине для обработки участков тела, загрязнённых патогенной флорой. Объясните, почему._____
Гр.___3
Лабораторная работа № 2
ВЫЯВЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Цель: выявить органические вещества в тканях (крахмал, белок, жиры) и изучить их свойства.
Оборудование: марлевый мешочек, размолотые зёрна пшеницы (пшеничная мука), 5%-ный раствор йода, семена подсолнечника (или любой другой масличной культуры: хлопчатника, лна, арахиса, сои и т. д.).
Органические соединения – углеродсодержащие вещества, характерные для живой природы, составляют в среднем 20-30% массы клеток живых организмов. Главные свойства клеток и организмов определяют органические полимеры: белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, а также сложные соединения – жиры и ряд молекул гормонов, пигментов, отдельных нуклеотидов, в частности АТФ. Помимо органических веществ в клетках содержатся минеральные вещества и вода, однако содержание органических веществ всегда выше. Количество органических веществ может быть различным.
Белки – нерегулярные, или информационные, полимеры, мономерами которых являются аминокислоты.
По своему составу белки подразделяются на:
- простые – состоят из одних аминокислот. Например, растительные белки – проламины, они содержатся в клейковине семян злаков, не растворяются в воде;
- сложные – помимо аминокислот имеют в своём составе другие органические соединения (нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы), соединения фосфора, металлы. Соответственно они носят названия: нуклеопротеидов, липопротеидов, гликопротеидов, фосфо- и металлопротеидов.
Углеводы – соединения, содержащие углерод, водород и кислород. Подразделяются на моно-, ди- и полисахариды. Полисахариды – высокомолекулярные углеводы, состоящие из большого числа моносахаридов, их молекулярная масса велика, молекулы имеют линейную или разветвлённую структуру. В функциональном отношении различают полисахариды резервного и структурного назначения. Не растворимый в воде крахмал – главный резервный полисахарид растительных клеток (полимер ά – глюкозы); при действии на него йода синеет; содержится в большом количестве в клубнях картофеля, плодах, семенах. Гликоген – полисахарид, содержащийся в тканях тела человека и животных, а также в грибах и дрожжах, - играет важную роль в превращениях углеводов в клетках. Клетчатка (целлюлоза) – основной структурный полисахарид клеточных оболочек растений.
Липиды и липоиды – жиры и жироподобные вещества – органические соединения с различной структурой. Они не растворяются в воде, но хорошо растворяются в органических соединениях: эфире, бензине, хлороформе и др..
По химической структуре липиды – соединения глицерина – трёхатомного спирта – с высокомолекулярными органическими кислотами (жирными), не имеют полимерной структуры.
Состав семян
| № | Наименование лабораторных тем | Количество часов |
| Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах. | ||
| Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом | ||
| Культивирование микроорганизмов глубинным способом | ||
| Определение активности солодовых амилаз. | ||
| Подготовка ферментного препарата и обработка мезги | ||
| Определение сыропригодности молока сычужной пробой | ||
| Определение бактериальной обсемененности молока | ||
| Исследование влияние тепловой обработки на свойства молока. | ||
| ИТОГО: |
Ферменты
Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, образуемые любой живой клеткой и обладающие способностью активизировать различные химические соединения.
Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации. Так, реакция АВ А + В в присутствии фермента идет следующим образом: АВ+Ф→АВФ; АВФ→А+ВФ; ВФ→В+Ф. →
Все ферменты разделяют на два большие класса: однокомпонентные и двухкомпонентные.
К первому классу относятся ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу - ферменты, которые состоят из белка и связанной с ним небелковой части, так называемой активной группой. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент, или простетическая группа. У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных или каталитических центров.
Одним из свойств ферментов, отличающихся от свойств неорганических катализаторов, является их большая лабильность - зависимость от ряда воздействий: концентрации водородных ионов, температуры, окислительно-восстановительных условий, концентрации некоторых соединений (продуктов обмена веществ), ионов металлов и т.п.
Вторая весьма существенная особенность каталитического действия ферментов состоит в том, что оно строго специфично, то есть действие ферментов направлено на совершенно определенные химические связи.
По характеру своего каталитического воздействия ферменты разделяются на шесть классов:
1) оксидоредуктазы или окислительно-восстановительные ферменты;
2) трансферазы, т.е. ферменты, катализирующие перенос различных групп атомов с одной молекулы на другую;
3) гидролазы, катализирующие гидролитические реакции;
4) лиазы - ферменты, которые отщепляют от субстратов ту или иную группу (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или наоборот, присоединяют к двойным связям;
5) изомеразы, т.е. ферменты, катализирующие реакции изомеризации органических соединении;
6) лигазы или синтетазы - к этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют синтетические реакции.
Каждый из этих классов подразделяется на подклассы, а эти последние, в свою очередь, на более мелкие группы.
На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.
В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.
Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить индикатором для контроля процесса сушки.
Исключительно велико биологическое значение амилаз при созревании и прорастании зерна, а также в ряде технологических процессов пищевых производств, имеющих в своей основе гидролитические превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.
В зерне злаковых культур содержится два специфических фермента, обусловливающих гидролиз крахмала, а именно:
1) -1,4 - глюкангидролаза или αα-амилаза, гидролизующая α-1,4 - глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно;
2) -1,4 – глюканмальтогидролаза или αβ – амилаза, гидролизующая α-1,4 – глюкановые связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей.
Несмотря на то, что протеазы имеют не менее важное значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения (ферментов, гидролизующих белки) оказались малоэффективными при изучении протеолитических ферментов зерна злаков. Под влиянием протеаз происходят разжижение клейковины, что, в свою очередь, приводит к ухудшению качества выпекаемого хлеба.
Липазы вызывают гидролиз жиров, т.е. расщепляют сложные эфиры глицерина с образованием свободных жирных кислот, в результате чего повышается кислотность зерна и муки.
При участии липоксигеназ происходит окисление непредельных жирных кислот, образуются низкомолекулярные карбонильные и карбоксильные соединения, обладающие неприятным запахом и горьковатым вкусом. Этот процесс называют прогорканием жиров (муки).
Лабораторная работа №1.
Тема: Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.
Цель работы: Выращивание продуцентов различных ферментов на твердых сыпучих средах и проведение анализа полученных культур на активность содержащихся в них ферментов.
Метод поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислород непосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы (анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих – для производства ферментных препаратов.
1.Подготовка посуды и ее стерилизация;
2.Приготовление питательной среды и ее стерилизация;
3.Расчет количества воды, необходимой для увлажнения питательной среды;
4.Увлажнение стерильной питательной среды, ее засев и раскладка в кюветы для выращивания;
1.Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена в сушильном шкафу.
Для стерилизации следует завернуть в бумагу, и аккуратно завязать веревочками следующие предметы: кювету, крышку к кювете.
Стерилизацию посуды и воды следует проводить в автоклаве при температуре 120ºС в течение 0,5 ч.
Стерильная посуда после автокловирования должна быть подсушена в сушильном шкафу при 105 ºС, так как бумага при стерилизации слегка увлажняется.
2. Приготовление и стерилизация питательной среды. Для каждого микроорганизма готовится своя питательная среда, обеспечивающих биосинтез определенных ферментов.Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно. Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо многослойную салфетку из марли, либо в широкий стеклянный стакан. Для Asp. oryzae, например, используется следующие варианты питательных сред: пшеничных отрубей-100,70; солодовых ростков-30; свекловичного жома-50; выжимок винограда-20; солодовых ростков-50; рисовой шелухи-50.
3. Для нормального развития микроскопического гриба и интенсивного образования ферментов необходимо, чтобы среда имела влажность 58-63%.
Расчет количества добавляемой воды проводится по следующим данным:
Acp- масса питательной среды с исходной влажностью;
Сср- масса питательной среды с требуемой влажностью;
Гср- масса питательной среды после стерилизации;
Д- количество воды, которое необходимо добавить для получения питательной среды требуемой влажности.
Лабораторная работа №2
Тема: Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом
Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.
Метод экстрагирования поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислороднепосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы(анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих- для производства ферментных препаратов.
В данной лабораторной работе удобнее всего использовать микроскопические грибы или дрожжеподобные микроорганизмы, например такие, как Asp niger. Rh. Delemar и др.
Лабораторная работа №3
Тема: Культивирование микроорганизмов глубинным способом.
Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов глубинным способом.
Глубинное культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом процессе весь объем питательной среды засевают посевным материалом и выращивание ведут в оптималных условиях определенный промежуток времени, пока не накопится нужное количество биомассы или целевого продукта. Для обеспечения роста аэробных культур в глубоких слоях жидкости необходимо поступление кислорода. Так как микробные клетки способны использовать только растворенный кислород, а растворимость его невелика(4-7 мг/г)
Простым и доступным способом периодического глубинного культивирования является выращивание аэробных культур в суспендированном состоянии в жидкой среде, разлитой в небольших объемах в пробирки и колбы.
Непрерывное глубинное культивирование ведут в лабораторных ферментаторах. Процесс непрерывного выращивания в ферментаторе осуществляется по типу хемостата или турбидостата.
Целью настоящей работы является выращивание продуцентов различных ферментов на жидких питательных средах глубинным способом и анализ получаемых культур микроорганизмов на содержание в них определенных ферментов.
Как в первой лабораторной работе необходимо полуичть посевной материал, который готовят, выращивая продуцент в несколько пассажей на агаризованных средах в пробирках или матрацах.
В лабораторной работе студент готовит 0,7дм 3 питательной среды. Первоначально на технических весах взвешивается стакан, а затем в стакан отвешиваются все необходимые компоненты среды. Жидкие компоненты среды отмериваются по объему.
Соли растворяются без особых предосторожностей. Крахмал или мука смешиваются в соотношении 1:10 с холодной водой и завариваются на кипящей водяной бане.
Варианты питательных сред для культивирования микроорганизмов- продуцентов ферментов.
Таблица 1
| Компоненты питательной среды | Варианты питательных сред и содержание компонентов,% | ||
| Asp. Oryzae | 0,3 | ||
| Кукурузный экстракт | 0,3 | 0,4 | 2,0 |
| Соевая мука | 0,5 | 4,0 | 2,0 |
| Кукурузная мука | 2,0 | - | 0,5 |
| Кормовые дрожжи | - | - | 0,2 |
| Карбонат кальция | - | 0,1 | 0,2 |
| Ash. bitatаe | 1,0 | ||
| Фильтрат полеспиртовой барды | 98,3 | 96,8 | - |
| Кукурузный крахмал | 1,5 | - | 0,2 |
| Технический магнезит | 0,2 | 0,2 | 1,5 |
| Ржаная мука | - | 2,5 | 1,0 |
| Кукурузный экстракт | 0,2 | 0,5 | 1,0 |
Для каждого варианта берут по четыре колбы, в каждую наливают по 120 см 3 приготовленной среды. Колбы закрывают ватными пробками, пробки прикрывают бумажными плотными колпаками, чтобы онине увлажнялись при стерилизации. Одновременно с качалочными колбами на стерилизацию ставят колбу с 50 см 3 среды для последующего определения ее рН.
Определения рН среды
рН среды определяют электрометрическим методом дважды: до и после стерилизации, осуществляется каждый раз по три повторности этих определений и анализируя затем достоверность этих результатов.
Засев питательной среды
После того как стерилизация окончена и автоклав открыт, пипетки помещают на 10-15 мин. В горячий сушильный шкаф для подсушивания бумаги, колбы и остальные посуды оставляют в автоклаве на 10-15 мин. Засев питательной среды проводят в боксе.
Лабораторная работа №4
Определение активности каталазы
Каталаза относится к первому классу ферментов (оксидоредуктаз) и катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород по уравнению:
Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, так как она разрушает ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.
Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:
2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO→ 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2
О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств 0,1 моль/дм 3 раствора КМnО 4 , израсходованных на титрование в контрольном и рабочем опытах.
Испытуемый материал: солод (проросшее зерно)
Реактивы: раствор перекиси водорода ω (H 2 O 2) = 1 %
раствор серной кислоты ω (H 2 SO 4) = 10 %
раствор перманганата калия С (1/5 KMnO 4) = 0,1 моль/дм 3
5 г испытуемого материала настаивают при комнатной температуре в течение 30 минут со 100 см 3 воды, периодически перемешивая содержимое колбы. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр и из прозрачного раствора отбирают пипеткой две порции по 20 см 3 (одна опытная и одна контрольная) и переносят каждую в отдельную коническую колбу на 200 см 3 . Контрольную кипятят 3 мин для инактивации фермента.
К опытной и контрольной пробам прибавляют по 20 см 3 дистил-лированной воды, по 4 см 3 перекиси водорода, и оставляют на 20 мин при комнатной температуре для действия фермента. По истечении 20 мин к пробам прибавляют по 5 см 3 серной кислоты, и оставшуюся (не разложившуюся) перекись водорода титруют раствором перманганата калия.
Активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложившейся под действием фермента за 1 мин в расчете на 1 г исследуемого материала.
Активность каталазы определяют по формуле:
где Х – активность каталазы;
а - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование контрольного раствора, см 3 ;
b - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование опытного раствора, см 3 ;
К – поправка к титру;
100 – общий объем экстракта, см 3 ;
50 – коэффициент пересчета на микромоли H 2 O 2 ;
20 – объем ферментного раствора, см 3 ;
20 – время ферментативной реакции, мин;
Р - навеска испытуемого материала, взятого для анализа, г.
Лабораторная работа №5.
Колориметрический метод определения активности α- и β-амилазы
Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высоко-полимерного углевода - крахмала - с образованием декстринов и мальтозы. В растениях встречаются α- и β-амилазы.
Раздельное количественное определение активности α- и β-амилаз основано на их различной термостабильности: β-амилаза разрушается нагреванием до 70 °С, α -амилаза при этом сохраняет свою активность.
Методы определения активности амилазы основаны либо на учете количества сахара, образовавшегося при действии фермента на крахмал, либо на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, которое определяют фотометрически после обработки раствором иода.
Реактивы: ацетатный буфер с рН 5,5;
раствор хлорида натрия ω (NаСl) =1 %;
раствор крахмала ω = 10 % , (2 г крахмала, размешанного в 20 см 3 холодной воды, выливают в 80 см 3 кипящей воды, после чего нагревают на кипящей водяной бане до просветления раствора);
раствор соляной кислоты С(HCl) =1 моль/дм 3
раствор соляной кислоты С(HCl) =0,1 моль/дм 3
раствор йода ω = 0,3 % в 3 %-ном растворе йодистого калия.
Навеску 0,5 - 1 г муки или проростков растирают в ступке с небольшим количеством 1 %-ного раствора NаСl и переносят в коническую колбу на 50 см 3 . Соотношение между навеской и раствором NаСl 1:10 или 1:20. Содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем фильтруют через плотный складчатый фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать фильтрование и центрифугирование при 4000-5000 об/мин. Прозрачный раствор используют как ферментный препарат.
Для определения активности α- и β-амилазы берут 4 пробирки (2 опытные и 2 контрольные) и вносят в них по 3 см 3 ацетатного буфера и 3 см 3 2%-ного раствора крахмала. Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до 40°С. Затем в опытные пробирки вносят по 0,2-1,0 см 3 ферментного препарата (в зависимости от активности амилаз в объекте изучения), а в контрольные - такое же количество Н 2 О. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 40 °С на 30 или 60 мин. После инкубации в каждую пробирку сразу приливают по 2 см 3 1 н. раствора НСl для прекращения действия амилаз.
Для выявления непрореагировавшего с ферментом крахмала проводят реакцию с йодом. В мерные колбы на 50 см 3 приливают около 30 см 3 воды, 1 см 3 0,1 н. НСl, 5 капель 0,3 %-го раствора иода и вносят из каждой пробирки по 0,5 см 3 смеси. Содержимое колб хорошо перемешивают, доводят до метки водой и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре или на спектрофотометре при 595 нм в кювете с рабочей длиной 1 см.
Для определения активности α-амилазы в коническую колбу на 100 см 3 приливают 5 см 3 фильтрата (ферментного препарата), добавляют на кончике ножа сухого уксуснокислого кальция и выдерживают в течение 15 мин в ультратермостате или на водяной бане при 70°С (допускаются колебания температуры не более 0,5°С). Затем содержимое колбы быстро охлаждают в сосуде с холодной водой. При таком прогревании β -амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Далее определение α -амилазной активности сводится к описанной выше процедуре.
Действие обоих ферментов выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала в условиях опыта (за 30 мин или 1 ч) на 1 г муки (проростков). Активность β-амилазы определяют по разности между суммарной активностью α- и β-амилаз и активностью α-амилазы. Активность амилаз на 1 г муки за 1 ч рассчитывают по следующей формуле:
где D - оптическая плотность контрольного раствора;
D 1 - оптическая плотность опытного раствора;
а - количество внесенного крахмала (60 мг);
m - масса навески, г;
V - объем исходной ферментной вытяжки, см 3
V 1 - объем вытяжки, взятой для инкубирования, см 3 .
Лабораторная работа № 6
©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-02-13
