Цитологическое исследование синовиальной жидкости (СЖ) является простым анализом, который позволяет при любом заболевании суставов с выпотом узнать о воспалительном или невоспалительном характере патологии. В случае воспаления анализ позволяет диагностировать группу метаболической артропатии, представленную в основном подагрой и хондрокальцинозом, когда внутрисуставные микрокристаллы (МК) вызывают воспаление. При этих недугах тестирование СЖ дает возможность осуществить быструю диагностику, точную и надежную.
Цитологические исследования синовиальной жидкости не дорогостоящие, минимально инвазивные, быстрые, технически доступные. При этом, особый интерес представляют два диагностических признака:
Таблица 1 – Разные типы СЖ по данным цитологии
Для анализа достаточен любой объём, так как тест требует только ничтожно малое количество образца. В свежем состоянии для анализа достаточно капли. СЖ собирают в стерильную пластмассовую пробирку. Для цитологического исследования синовиальной жидкости необходимо применение антикоагулянта. Лучший выбор - гепаринат натрия; оксалат кальция и гепаринат лития должны быть исключены, так как они содержат МК, которые могут быть фагоцитированы полиморфноядерными клетками. По той же причине следует избегать попадания в образец частиц таких как, например, тальк или крахмал с перчаток.
Этот шаг цитологического исследования СЖ следует выполнить как можно скорее после сбора, без задержки каплю (0,05 мл) образца смотреть под покровным стеклом. Центрифугирование не требуется, потому что низко клеточные СЖ редко бывают патологическими. Идентификация МК является трудной задачей и требует поляризационного микроскопа, возможно, с компенсатором и поворотным столом, что позволяет более легко увидеть МК особенно, если их мало. За неимением поляризационного микроскопа анализ может быть осуществлен с сильно закрытой диафрагмой микроскопа, когда выявляются элементы, у которых показатель преломления, отличный от показателя преломления клеточных компонентов. Можно дополнить это исследование определением числа клеток в камере Горяева, что важно для определения природы поражения суставов (табл. 2).
Основные патологические состояния и типы СЖ
|
Не воспалительные |
Воспалительные |
Геморрагии |
|
|
Ревматоидный полиартрит |
Бактериальные инфекции |
Травмы-переломы |
|
|
Микрокристаллический артрит |
Туберкулез |
Геморрагический синдром |
|
|
Остеонекроз |
Синдром Рейтера |
Гемофилия |
|
|
Остеохондрит рассекающий |
Псориатический ревматизм |
Виллезонодулярный синовит |
|
|
Остеохондроматоз |
Ревматизм при воспалительных заболеваниях кишечника |
Гемангиома |
Если невозможно немедленное цитологическое исследование образца синовиальной жидкости, то его можно отложить до 24 часов, при условии сохранения СЖ при 4 °C или, еще лучше, в морозильнике при - 20 °C. Возможно также приготовить мазок и высушить на воздухе. К могут быть рассмотрены либо прямо, в поляризованном свете, либо после окрашивания по Мей- Грюнвалд -Жиамсу (МГЖ).
3.Окраска по МГЖ
Результаты подсчета количества клеток в свежей СЖ дополняются подсчетом отдельных типов клеток после цитоцентрифугирования, приготовления мазка и окрашивания по МГЖ, что позволяет уточнить природу клеток, присутствующих в СЖ.
Результаты
Цитологическое исследование синовиальной жидкости - тест, полезный для клиницистов, так как позволяет ориентировать обследование на конкретную патологию из многочисленных, которыми может страдать пациент. Для метаболических или микрокристаллических поражений суставов такой анализ является ключевым в обследовании (таблица N 3).
Таблица 3 - Цитологические показатели СЖ при микрокристаллических артритах
Цитологическое исследование синовиальной жидкости выявляет очень большое количество клеток с преобладанием полинуклеаров, часто видоизмененных . Если инфекция подавлена антибиотиками, то число ПЯЛ менее многочисленное и доказательство инфекции должно основывается на бактериологическом анализе СЖ или на гистологическом исследовании биоптата синовиальной оболочки. Если СЖ богата эозинофилами, необходимо искать микрофиллярии.
Здесь снова клеточность имеет важное значение, а полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ) самые многочисленные. Эта группа патологии суставов не имеет особого цитологического профиля, отражающего конкретный ревматизм. Но статистически более воспалительными являются СЖ при ревматоидном и реактивном артрите (Фиссингер-Лерой-Рейтера спондилоартрите), чем при СКВ полиартрите, ревматическом пельвиоспондилите или псориатическом артрите.
Метаболические или микрокристаллические артриты
Именно для этой группы заболеваний цитологическое исследование синовиальной жидкости является обоснованным и интересным. Следует отметить, что обнаружение МК не устраняет инфекции, и что бактериологическое обследование остается желательным во всех случаях.
Подагра всегда связана с наличием в полости сустава бесчисленного множества МК 
уратов мононатрия, очень характерной формы и физических характеристик. Это удлиненные МК, игольчатой формы, размером 5-20 микрон в длину, с коническим концом, прокалывающим клеточные мембраны. Жидкость, как правило, очень воспалительная и богата нейтрофилами (рис. 1).
Очень маленькие кристаллы (1-2 мкм) можно увидеть в при бессимптомных выпотах в период между обострениями подагры. Теперь они зачастую внеклеточные. МК натрия урата растворимы в воде, не сохраняются и не выявляются в мазках, окрашенных по МГЖ.
Эта патология обусловлена наличием в хряще и/или синовиальной оболочке отложений МК дигидрата пирофосфата кальция, вызывающих в острый период симптомы либо псевдоподагры, либо воспалительного ревматоидного или остеоартрита. Ключ к диагностике 
– выявление характерных МК в СЖ. МК длинной 5-10 мкм, внутри лейкоцитов, в форме прямого или косого параллелепипеда. Их двойное лучепреломление меньше, чем К мочевой кислоты. Эти МК мало растворим в воде и сохраняются после окрашивания по МГЖ. Иногда анализ СЖ в свежем состоянии или после окрашивания МГЖ показывает одновременно МК уратов и пирофосфатов. Эти смешанные поражения суставов не исключительны.
У некоторых пациентов, часто страдающих от кальциноза вращающей манжеты плечевого сустава, может развиться деструктивная артропатия и признаки воспаления СЖ. Симптомы воспаления СЖ связаны с присутствием МК, 
принадлежащих различным формам фосфата кальция. Наиболее часто – гидроксиапатита, но можно найти и октакальций фосфат и трикальций фосфат. Длина этих кристаллов 0, l - 0,2 µm, они невидны в оптическом микроскопе.
При исследовании свежей СЖ иногда выявляются другие разновидности МК, которые включают в себя:
МК иногда пирамидальной, иногда неправильной формы или палочки, которые можно принять за пирофосфат кальция;
микрокристаллический артрит. Их форма - переменная величина и они все двулучепреломляющие;
Цитологическое исследование суставной жидкости - ценный диагностический тест, мало инвазивный, быстрый, доступный, при котором:
Обилие клеток - верное отражение воспалительного характера заболевания суставов,
Наличие или отсутствие МК позволяет подтвердить или исключить, в течение нескольких минут, микрокристаллическую артропатии, и часто определить характер метаболической артропатии.
4292 0
Синовиальная жидкость играет исключительную роль в функционировании суставов и сухожилий. Ее образование идет постоянно из веществ плазмы и продуктов клеток покровного эпителия синовиальных образований. Количество СЖ в разных суставах разное.
У здорового человека СЖ имеет светло-желтый цвет, она прозрачная, очень вязкая, стерильная. До 1/3 ее состава представляют белки, фибрина в ней нет, но имеется глюкуроновая кислота в виде комплекса с белками (муцин). Нормальная СЖ содержит клетки покровного эпителия синовии и лейкоциты, из которых количество лимфоцитов достигает 75%, нейтрофилов мало — 0-25%, синовиацитов - 0- 12%.
Возникающая суставная патология приводит к почти мгновенной реакции синовиальной оболочки, что существенно меняет состав СЖ. Для некоторых видов патологии можно выделить очень характерные ее отклонения, что используется как важный дифференциально-диагностический критерий. Получить СЖ для визуального и лабораторного исследования можно только с помощью пункции сустава или синовиального образования и при артроскопии.
После получения наливная СЖ оценивается по количеству, цвету, прозрачности, плотности муцинового сгустка, вязкости, общему цитозу. При необходимости проводится поиск кристаллов в поляризованном свете, бактериоскопия с окраской по Грамму и микробиологический посев.
Физические свойства СЖ в норме и при основных ревматолошческих процессах представлены в табл. 11.
Таблица 11. Физические свойства синовиальной жидкости (Насонова В.А., Бунчук Н.В., 1997)
Таблица 12. Визуальные и лабораторные признаки СЖ при различных заболеваниях
Содержимым синовиального образования может быть кровь, что наблюдается при травме, а также гной.
Цвет СЖ в норме и при нсвоспалительных заболеваниях суставов светло-желтый, соломенный. При воспалительных заболеваниях он может быть лимонным, янтарным, зеленоватым, серым, бурым, молочно-желтым, белым, розовым.
Прозрачность. Нормальная СЖ прозрачная, при невоспалительных заболеваниях она может быть также прозрачной или полупрозрачной, при воспалительных — умеренно или интенсивно мутной.
Вязкость. Ее можно определить визуально по тягучести при переливании из шприца в пробирку или по длине муциновой нити на предметном стекле. Для этого 1 -2 капли пуиктата наносят на стекло и стеклянной палочкой его оттягивают в сторону. Различают 3 степени вязкости: низкая, когда длина нити будет 1 см, средняя — до 5 см, высокая — длина нити более 5 см. Нормальная СЖ имеет высокую вязкость. Вязкость СЖ обусловлена концентрацией и степенью полимеризации содержащейся в ней гиалуроиовой кислоты. Вязкость снижается при воспалительных процессах за счет уменьшения концентрации в СЖ и деполимеризации гиалуроиовой кислоты.
Муциновый тест. При добавлении к нормальной СЖ уксусной кислоты в ней образуется сгусток муцина или осадок. Если имеется воспалительное заболевание, то сгусток будет меньшим по величине, рыхлым или умеренно рыхлым.
Примесь крови. Кровь в СЖ появляется при травматических повреждениях сустава и других синовиальных образований, при травме сустава у больных гемофилией, при очень остро протекающем артрите любого генеза, при пигментном виллезонодуляриом синовите. Примесь крови в СЖ из поврежденной синовии пунктирующей иглой бывает редко и лишь при грубом выполнении манипуляций.
Цитоз. Подсчет общего числа клеток в СЖ производится в счетной камере. Клеточный состав в нормальной СЖ представляется клетками покровного слоя синовиальной оболочки и лейкоцитами. В норме количество лейкоцитов может быть в пределах 200-600 в мм3. При слабом воспалении оно достигает 2000 в мм3, при выраженном — от 2000 до 75 000 в мм3, при септическом артрите — более 100 000 в мм3. В норме в СЖ преобладают лимфоциты, нейтрофилов не более 25%.
Подобное бывает и при невоспалительных процессах. При синовите резко возрастает (до 90%) количество полиморфно-ядерных нейтрофилов.
Рагоциты. Эти клеточные элементы в нормальной СЖ отсутствуют. При воспалительных заболеваниях и серонегативиом спондилоартрите их количество составляет 2-15% от общего числа клеток, а при ревматоидном артрите их может быть до 40% и более, что зависит от выраженности местной воспалительной активности.
Общий белок. В норме СЖ содержит 15-20 г/л белка. При невоспалительных артритах его количество увеличивается до 22-37 г/л, при воспалительных — до 35-48 г/л, а при ревматоидном артрите и кристаллическом синовите его может быть до 70 г/л.
Ревматоидный фактор и С-реактивный белок. В норме РФ в СЖ не содержится, а количество СРВ не более 0,001 г/л. При невоспалительных заболеваниях суставов и серонегативиых спондилоартритах РФ не определяется или обнаруживается в титре 1/20—1/40 серогюзитивпых артритах его титр превышает 1/40. Воспалительные заболевания суставов сопровождаются увеличением СРВ от 0,01 до 0,06 г/л и более.
Кристаллы. Они исследуются с помощью поляризационной микроскопии. Надежно идентифицируются только кристаллы уратов и пирофосфата кальция.
И.А. Реуцкий, В.Ф. Маринин, А.В. Глотов
[02-049 ] Микроскопическое исследование синовиальной жидкости
635 руб.
Заказать
Исследование синовиальной жидкости с описанием ее физико-химических свойств и характеристикой клеточных элементов, котороепроводится для диагностики различных воспалительных заболеваний суставов и дистрофических процессов.
Синонимы русские
Синонимы английские
Метод исследования
Микроскопия.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Синовиальную жидкость.
Общая информация об исследовании
Анализ показан больным с поражением одного или нескольких суставов неясного генеза, проявляющихся болезненностью суставов и их отечностью, в случае когда исследование синовиальной жидкости (СЖ) поможет в постановке диагноза. Анализ включает в себя определение физико-химических свойств жидкости и микроскопическое исследование клеточных элементов. Наиболее серьезным основанием для его назначения является необходимость исключить инфекционный процесс в суставе. В случае воспаления синовиальная жидкость часто собирается в верхнем суставном этаже, образуется "суставной выпот". Синовиальная жидкость берется путем пункции сустава. Инфекционные осложнения при этом бывают крайне редко.
Синовиальная жидкость служит "смазкой" для хрящей и связок. По изменению ее клеточного состава и физико-химических свойств можно судить о патологических процессах в суставе. Например, известно, что синовиальная жидкость в суставах, пораженных остеоартрозом, имеет более низкую вязкость и эластичность, чем синовиальная жидкость в здоровых суставах.
В частности, одним из критериев такого воспалительного заболевания суставов, как подагра, является обнаружение кристаллов мочевой кислоты в синовиальной жидкости. Причем определение мочевой кислоты в синовиальной жидкости имеет большее прогностическое значение, чем анализ сыворотки крови, так как концентрация мочевой кислоты в сыворотке в период острого приступа может быть в пределах нормы, а кристаллы мочевой кислоты в синовиальной жидкости обнаруживаются даже в межприступном периоде.
У больных с ревматоидным артритом исследование синовиальной жидкости имеет большое значение для подтверждения диагноза и определения местной активности воспалительного процесса. При ревматоидном артрите количество лейкоцитов в синовиальной жидкости повышается до 25 000 в 1 мкл за счет нейтрофилов (25-90 %), содержание белка достигает 40-60 г/л. В цитоплазме лейкоцитов обнаруживают включения, вакуоли, похожие на кисть винограда (рагоциты). Эти клетки содержат фагоцитированный материал – липидные или белковые вещества, ревматоидный фактор, иммунные комплексы, комплемент. Рагоциты обнаруживают и при других заболеваниях – ревматическом, псориатическом артритах, системной красной волчанке, бактериальных артритах, подагре, – но не в таком количестве, как при ревматоидном артрите.
Наиболее выраженные изменения в синовиальной жидкости обнаруживают при бактериальных артритах. Внешне синовиальная жидкость может иметь вид гноя; содержание клеток достигает 50 000-100 000 в 1 мкл, из них нейтрофилы составляют более 80 %. Иногда в первые 24-48 ч. острого артрита количество клеточных элементов может быть меньше 25 000 в 1 мкл.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
В здоровом суставе синовиальная жидкость является прозрачной. При ревматоидном, псориатическом или септическом артрите происходит ее помутнение.
Цвет жидкости в норме светло-желтый. При воспалении он меняется в зависимости от характера изменений в синовиальной оболочке, например, при ревматоидном и псориатическом артрите окраска колеблется от желтого до зеленого цветов.
Число клеток в препарате в норме – до 200 клеток/мкл. Увеличение количества клеток (цитоз) позволяет дифференцировать воспалительные и дистрофические заболевания и оценивать динамику воспалительного процесса. Выраженный цитоз (30 000 – 50 000) характерен для острого периода воспаления при любых артритах, умеренный цитоз (до 20 000 – 30 000) отмечен при псевдоподагре, синдроме Рейтера, псориатическом артрите. Незначительный цитоз характерен преимущественно для микрокристаллических артритов. Цитоз более 50 000 в большинстве случаев указывает на наличие бактериального артрита.
В синовиальной жидкости может быть идентифицировано большое количество разнообразных кристаллов. Однако диагностическую ценность представляют только два типа из них. Кристаллы урата натрия являются признаком подагры, а кристаллы дигидропирофосфата кальция обнаруживаются при псевдоподагре. Эти кристаллы могут быть выявлены при поляризационной микроскопии.
В норме в синовиальной жидкости обнаруживаются и клетки тканевого происхождения (синовиоциты, гистиоциты), а также элементы крови. Это преимущественно лимфоциты, реже – нейтрофилы и моноциты. При воспалении в синовиальной жидкости могут встречаться особые формы нейтрофилов – рагоциты. Их клетки имеют "ячеистый" вид за счет включения иммунных комплексов в цитоплазму. Это наиболее характерные признаки при ревматоидном артрите. При некоторых состояниях (аллергические синовиты, туберкулезный процесс, артриты на фоне новообразований) в синовиальной жидкости преобладают мононуклеары.
Изменения синовиальной жидкости при различных патологических процессах
|
Признак |
Тип изменений |
||
|
Невоспалительный |
Воспалительный |
Септический |
|
|
Соломенно-желтый |
Варьируется |
||
|
Прозрачность |
Прозрачная |
Полупрозрачная |
|
|
Лейкоциты, в 1 мкл |
2 000 – 75 000 |
||
|
Нейтрофилы, % |
|||
|
Кристаллы |
|||
|
Бактериологическое исследование |
Отрицательное |
Отрицательное |
Иногда положительное |
|
Заболевания |
Остеоартроз, травматический артроз, асептический некроз, системная красная волчанка |
Ревматоидный артрит, подагра, псевдоподагра, системная красная волчанка, серонегативные спондилоартропатии |
Гонококковый артрит, туберкулезный артрит, инфекционный артрит (стафилококковый и стрептококковый) |
Изменения синовиальной жидкости при артрите и артрозе
Важные замечания
Кто назначает исследование?
Ортопед, хирург, ревматолог, артролог.
Литература
6852 0
Нормальная СЖ стерильная, светло-желтая, прозрачная и вязкая, цитоз не превышает 0,18 . 109/л. Клеточный состав СЖ представлен клетками покровного слоя синовиальной оболочки и лейкоцитами, при этом в норме преобладают моноциты и лимфоциты (до 75%), количество полиморфно-ядерных нейтрофилов колеблется от 0 до 25%, а синовиоцитов — от 0 до 12%.
Количество. В норме 0,2—2 мл, при суставных заболеваниях 3—25 мл и более.
Цвет. В норме светло-желтый; при дегенеративно-дистрофических заболеваниях — светло-желтый, желтый, соломенный; при воспалительных — от светло-желтого до бурого, лимонный, янтарный, серый, розоватый.
Прозрачность. Различают четыре степени прозрачности СЖ: прозрачная, полупрозрачная, умеренно мутная, интенсивно мутная. В норме СЖ прозрачная, при невоспалительных заболеваниях суставов — прозрачная, полупрозрачная, при воспалительных — умеренно или интенсивно мутная.
Осадок. В норме осадка нет; при воспалительных заболеваниях суставов осадок обнаруживается практически всегда. Как правило, это обрывки клеточных мембран, фибриновых нитей, коллагеновых волокон, фрагменты хряща и синовиальной оболочки, образующиеся в процессе деструкции, в ряде случаев также кристаллы.
Плотность муцинового сгустка. В норме муциновый сгусток плотный, при невоспалительных заболеваниях суставов — умеренно плотный, при воспалительных — рыхлый или умеренно рыхлый.
Вязкость. Вязкость СЖ определяют различными способами. В рутинных исследованиях вязкость СЖ принято определять по длине муциновой нити. Различают три степени вязкости: низкая — до 1 см, средняя — до 5 см и высокая — свыше 5 см. В норме вязкость СЖ высокая, при невоспалительных заболеваниях суставов — средняя, при воспалительных — низкая.
Существуют также инструментальные методы оценки вязкости СЖ с применением вязкозиметров Оствальде или Бишоффа.
Цитоз. В пробирки, содержащие 0,4 мл изотонического раствора натрия хлорида, добавляют по 0,02 мл СЖ. Подсчет общего числа клеток производят в счетной камере. При невоспалительных заболеваниях суставов общее число клеток не превышает 3 . 109/л, при воспалительных — колеблется от 3 . 109/л до 50 . 109/л. В септической СЖ цитоз превышает 50 . 109/л.
Синовиоцитограмма. При невоспалительных заболеваниях суставов в СЖ преобладают лимфоциты (до 80%), при воспалительных — полиморфно-ядерные нейтрофилы (до 90%).
Рагоциты. В нормальной СЖ рагоцитов нет. При невоспалительных заболеваниях суставов и серонегативных спондилоартритах количество рагоцитов составляет от 2 до 15% от общего числа клеток. При РА количество рагоцитов достигает 40% и более в зависимости от степени местной воспалительной активности.
Кристаллы. Кристаллы в СЖ идентифицируют при помощи поляризационного микроскопа. Довольно надежно идентифицируются кристаллы уратов и пирофосфата кальция, имеющие противоположные оптические свойства. Кристаллы гидроксиаппатита в связи с небольшими размерами могут быть выявлены только при электронной микроскопии.
Общий белок. В норме содержание белка в СЖ составляет 15—20 г/л, при воспалительных заболеваниях — 35—48 г/л, при РА — до 60 г/л.
Ревматоидный фактор, С-реактивный белок. В нормальной СЖ ревматоидный фактор не обнаруживается, при невоспалительных заболеваниях суставов может определяться в небольшом титре — 1:20—1:40; при серопозитивном РА титр ревматоидного фактора в СЖ существенно превышает 1:40. Уровень СРБ в СЖ при невоспалительных заболеваниях суставов составляет 0,001 г/л, при воспалительных — от 0,01 до 0,06 г/л и выше.
В.И. Мазуров
3.5.1.Требования к образцу синовиальной жидкости для микроскопического исследования.
Перед проведением микроскопического исследования врач должен иметь информацию о времени получения синовиальной жидкости и результатах оценки физико-химических свойств.
В настоящее время для взятия биологических жидкостей выпускаются вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт (К 2 ЭДТА), который является также консервантом для клеточных элементов и не влияет на их морфологию.
П р и м е ч а н и е 1 ─ Синовиальную жидкость, стабилизированную К 2 ЭДТА нельзя использовать для обнаружения рагоцитов.
Проводится три вида микроскопического исследования:
подсчет клеток в нативной синовиальной жидкости в камере Горяева (цитоз), исследование нативного препарата и окрашенного азур-эозином препарата с подсчетом синовиоцитограммы.
3.5.2 Подсчет количества клеточных элементов в 1 мкл синовиальной жидкости камере Горяева (определение цитоза).
Ход исследования.:
Исследование проводят в нативной или стабилизированной К 2 ЭДТА синовиальной жидкости.
В пробирку налить 0,4 мл изотонического или гипотонического раствора NaCI.
С помощью семплера или микропипетки внести 20 мкл СЖ (разведение 1:20).
Содержимое пробирки аккуратно без пены размешать.
Расчет произвести по формуле: , где
А – количество клеточных элементов в 40 больших квадратах камеры Горяева;
250 - 1/250 – объем одного большого квадрата камеры;
20 - степень разведения СЖ.
Окончательный вариант формулы: 
Если при микроскопии нативного препарата СЖ обнаружено, что клетки покрывают все поля зрения или СЖ имеет высокую вязкость, необходимо разведение - 1: 200 (4 мл изотонического или гипотонического раствора NaCI и 20 мкл исследуемой СЖ).
Для разведения СЖ используется изотонический 0,9% (150ммоль/л) раствор NaCI. Если в СЖ необходимо лизировать эритроциты, используется гипотонический 0,3% (50ммоль/л) раствор NaCI.
Изотонический и гипотонический растворы NaCI можно подкрашивать 3% раствором метиленового синего или метилвиолета.
При разведении в 200 раз окончательный расчет проводят по формуле: Х =А 1250
В нормальной СЖ число клеток варьирует и составляет 0.1 – 0.5 х10 9 /л.
П р и м е ч а н и е ─ При суставной патологии цитоз увеличивается, свидетельствуя о нарастании воспалительного процесса. При дегенеративных заболеваниях и посттравматическом артрите цитоз в СЖ составляет 2 - 2,5х10 9 /л. При воспалительных заболеваниях суставов (РА, .РеА, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, подагра, псевдоподагра) цитоз варьирует от 3 до 75х10 9 /л, при септических артритах превышает 80х10 9 /л.
3.5.3 Приготовление нативных и окрашенных препаратов для микроскопического исследования.
В лаборатории должна быть утверждена процедура подготовки синовиальной жидкости и приготовления нативного и окрашенного азур-эозином препаратов для микроскопического исследования и процедура проведения этих микроскопических исследований. Каждый сотрудник должен выполнять все этапы анализа одинаковым способом, оценивать обнаруженные при микроскопии клеточные элементы и кристаллы, используя одни и те же критерии для идентификации.
Препараты для микроскопического исследования (нативные и окрашенные) могут быть приготовлены как непосредственно из СЖ без центрифугирования, так и из осадка, полученного путем центрифугирования образца СЖ (например, для определения кристаллов).
Если СЖ мутная с низкой вязкостью, ее можно сразу наносить на предметное стекло.
Для приготовления нативного препарата капля СЖ наносится на предметное стекло и покрывается покровным.
Мазок для последующей окраски готовится аналогично мазку крови: на край предметного стекла наносят каплю СЖ, шлифованным краем другого стекла (или пластикового шпателя) под углом 45 ◦ выравнивают каплю по стеклу и эатем быстрым движением с небольшим нажимом, чтобы предотвратить разрушение клеток, распределяют по стеклу, не доходя до края стекла на 1 – 1,5 см.
Для получения большей концентрации клеток в микроскопическом препарате можно использовать приготовление мазка на основе толстой капли. На стекло наносится большая (толстая) капля СЖ, которая распределяется по нему шлифованным стеклом медленно и без нажима.
Увеличение концентрации клеток может быть достигнуто также методом центрифугирования СЖ и получения сконцентрированного осадка.
Прозрачную или полупрозрачную СЖ, независимо от величины вязкости, рекомендуют центрифугировать.
В центрифужную пробирку помещают синовиальную жидкость.
Центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. при 5-7 ◦ С. С помощью пастеровской пипетки отсасываются надосадочную синовиальную жидкость (супернатант) и оставляют только осадок. Этой же пипеткой аккуратно без пены перемешивают осадок.
1 каплю осадка (приблизительно 40 мкл) переносят этой же пастеровской пипеткой (с баллончиком и тонко оттянутым концом) на предметное стекло и покрывают покровным (нативный препарат). Покровное стекло должно покрывать каплю осадка полностью без пузырей.
Затем из этого осадка готовится мазок для окраски азур-эозином. Клетки в осадке сконцентрированы, что безусловно облегчает микроскопию и подсчет процентного содержания отдельных клеток. Однако этот способ имеет существенные недостатки: при самых щадящих условиях центрифугирования может страдать структура некоторых синовиальных клеток, а также происходить их разрыв.
При малом объеме синовиальной жидкости, например, жидкость находится только в пункционной игле, содержимое иглы выдувают поршнем шприца на предметное стекло и из этой капли делают мазок или вначале покрывают ее покровным стеклом и предварительно на иммерсии исследуют нативный препарат. Затем снимают покровное стекло, аккуратно распределяют материал по предметному стеклу, высушивают, фиксируют и окрашивают этот препарат азур-эозином.
Если капля СЖ вязкая и густая, разведение делают на этом же предметном стекле,
добавляя к капле СЖ 2-4 капли физиологического раствора, после чего
аккуратно смешивают уголком пластикового шпателя или предметного стекла каплю СЖ с каплями физиологического раствора, наносят на другое предметное стекло каплю разведенной СЖ, распределив ее по ширине шлифованной поверхности шпателя или шлифованного стекла, легким движением сделать мазок, так чтобы он занимал 2/3 предметного стекла.
Независимо от того, готовится ли мазок из цельной СЖ или осадка, мазок должен быть равномерным и заканчиваться щеточкой.
Используются обычные способы фиксации и окраски мазков, аналогичные применяемым в гематологических исследованиях: приготовленные мазки подсушивают на воздухе без подогрева, затем фиксируют по методу Май-Грюнвальда, окрашивают по методу Романовского-Гимзы или модификации этого метода; наиболее чувствительным и специфичным для определения клеточного состава СЖ считается метод Паппенгейма. (см. ГОСТ Р Цитологические исследования пунктата костного мозга).
Стандартизация приготовления препаратов из синовиальной жидкости позволяет получить сравнимые результаты микроскопического исследования в разных лабораториях.
3.5.4 . Микроскопическое исследование нативного препарата синовиальной жидкости.
Изучение препарата начинают с малого увеличения (ок. х 7, 10 или х 20, об. х 10) для общего обзора и более детального изучения препарата на большом увеличении (ок х10 и об.х40. Для достоверного обнаружения рагоцитов в нативном препарате рекомендуется использовать фазово-контрастную микроскопию, или исследовать препарат с иммерсией. Для идентификации кристаллов рекомендуется использовать поляризационный микроскоп.
В нативном препарате при увеличении х70, х100 или х200 можно получить только ориентировочное представление о лейкоцитах, обнаружить эритроциты и тканевые клеточные элементы. При увеличении х400 перечисленные клеточные элементы видны более четко. При микроскопии на этих увеличениях удобно поднять до упора конденсор и максимально закрыть диафрагму. Такой режим работы обеспечивает большую четкость нативных клеточных элементов.
Эритроциты, содержащие гемоглобин, при увеличении х400 по форме похожи на двояко вогнутые линзы желтовато-розоватого цвета. Это неизменные эритроциты они сохраняют форму и гемоглобин благодаря рН синовиальной жидкости, которая колеблется в пределах от 7,0 до 8,5. Эритроциты попадают в синовиальную жидкость при травмах суставов или во время пункции.
Лейкоциты при воспалении суставов представлены в синовиальной жидкости нейтрофилами. Нейтрофилы бесцветные или сероватые, мелкозернистые правильной круглой формы клетки. Иногда (при аллергических состояниях) можно обнаружить в синовиальной жидкости эозинофилы, которые отличаются от нейтрофилов по характерной равномерной, сферической, желтоватого цвета зернистости, но дифференцировать лейкоциты в нативных препаратах не следует.
Рагоциты.
Рагоциты - это макрофаги, содержащие в своей цитоплазме резко преломляющие свет гранулы, размер которых больше, чем размер внутриклеточной зернистости в цитоплазме этих клеток. Эти гранулы могут быть бесцветные, зеленоватые или черные, в зависимости от преломления проходящего через них света. Размер гранул варьирует от 0,20 до 0,33 мкм. За счет этих гранул размер рагоцитов несколько больше нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, не содержащих этой зернистости. Эти гранулы содержат иммунные комплексы, в состав которых входит ревматоидный фактор, а также иммуноглобулины и антинуклеолярный фактор.
Обнаружение и подсчет рагоцитов, производятся в нативном препарате с использованием фазово-контрастной микроскопии или иммерсии.
На покровное стекло, которое покрывает нативный препарат, наносят каплю иммерсионного масла и устанавливают иммерсионный объектив, получая увеличение х900 или х1000. Подсчитывают 100 клеточных элементов (лейкоцитов, рагоцитов и тканевых клеток) и отмечают, сколько процентов из них составляют рагоциты
П р и м е ч а н и е 1 ─ При ревматоидном артрите количество рагоцитов может достигать 50% клеточного состава.
Кристаллы
В норме СЖ не содержит кристаллов, они обнаруживаются при различных заболеваниях суставов.
Для идентификации большинства кристаллов в СЖ используют метод поляризоционной микроскопии при увеличении 300 – 500.
Подсчет кристаллов проводят в нативном препарате цельной СЖ.
Кристаллы моноурата натрия (С 5 Н 3 NaN 4 O 3) игловидной или полосковидной формы длиной 2 - 30 мкм, обладают сильным двулучепреломлением, хорошо различимы в нативном препарате и легко отличаются от других кристаллов. В полярзационном микроскопе на черном фоне игольчатые кристаллы хорошо видны как «белые искры».
Эти кристаллы часто обнаруживаются внутриклеточно в нейтрофилах и макрофагах.
П р и м е ч а н и е 2 ─ кристаллы моноурата натрия типичны для подагры.
Пирофосфат кальция
Пирофосфат кальция – кальций пирофосфат дигидрат или дигидропирофосфат кальция (CаPPD) Ca 2 P 2 O 7 2H 2 O. Эти кристаллы имеют форму коротких или длинных полосковидных прямоугольников или ромбов с тупыми концами размером 2 - 10 мкм и обладают слабым двулучепреломлением, растворимы в 10 % растворе ЭДТА.
П р и м е ч а н и е 3 ─ эти кристаллов в синовиальной жидкости обнаруживаются при хондрокальцинозе и пирофосфатной артропатии..
Гидроксиапатит
Гидроксиапатит - Ca 5 (PO 4) 3 OH. - кристаллы очень мелкие, практически не различимы при обычном увеличении ни в световом, ни в поляризационном микроскопах. В поляризационном микроскопе можно обнаружить только друзы этих кристаллов размером 5 – 20 мкм. В фазовоконтрастном микроскопе кристаллы гидроксиапатита обнаруживаются внутри полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов) и внеклеточно, как светлые диски диаметром 2-3 мкм.
Эти кристаллы могут быть обнаружены по яркокрасной окраске при применении ализаринового красного.
Метод окраски СЖ ализариновым красным.
Реактивы: 2% водный раствор ализаринового красного с рН 4,2 (рН доводят с помощью гидроокиси аммония).
Суспензию профильтровать и хранить в холодильнике в склянке из темного стекла. Непосредственно перед исследованием необходимое количество краски профильтровать через миллипоровый фильтр.
20 мкл краски смешать с равным объемом СЖ или осадка, полученного после центрифугирования. Приготовить нативный препарат и микроскопировать лучше в поляризационном микроскопе: кристаллы овоидной формы, 2-3 мкм в диаметре, насыщенной красной окраски с розовым ореолом.
П р и м е ч а н и е 4 ─ Эти кристаллы обнаруживаются при гидроксиапатитной артропатии.
В синовиальной жидкости могут быть также обнаружены кристаллы оксалата кальция, холестерина, липидов, Шарко-Лейдена и др.
П р и м е ч а н и е 5 ─ Кристаллы оксалата кальция (С 2 СаО 4 Н 2 О) имеют обычно кубическую форму но могут образовывать бесцветные, блестящие, сильно преломляющие свет кристаллы различной величины в форме октаэдров или прямоугольников, напоминающих почтовые конверты. Иногда встречаются кристаллы оксалата кальция округлой формы и с перехватом, напоминающие песочные часы, гимнастические гири или банты (С 2 СаО 4 2Н 2 О). Эти кристаллы могут фагоцитироваться полиморфоядерными лейкоцитами (нейтрофилами).
П р и м е ч а н и е 6 ─ Жидкие кристаллы липидов представлены на темном поле в виде черных мальтийских крестов, делящих каждую каплю липида на четыре белых блестящих сегмента. Капли нейтрального жира не обладают эффектом двулучевого преломления света.
Кристаллы холестерина, оксалата натрия и жидкие кристаллы липидов не специфичны для какого-либо определенного суставного заболевания и могут встречаться при различных артропатиях, отражая нарушение метаболизма.
П р и м е ч а н и е 7 ─ В СЖ можно обнаружить амилоидные глыбки. Это бесцветные образования округлой формы, слоистого строения, напоминающего спил дерева, с характерным блеском. Идентифицируются в нативных препаратах при увеличении х400, а также с иммерсией при увеличении х1000. Амилоид можно определить в нативной СЖ, окрашенной красным конго. Полученный препарат можно смотреть как в световом, так и в поляризационном микроскопе.
Амилоидные глыбки находят при заболеваниях, слпровождающихся амилоидной артропатией.
Кристаллы гематоидина.
Кристаллы гематоидина образуются при распаде гемоглобина в гематомах без доступа кислорода. Это слегка вытянутые в длину ромбики и/или иглы золотисто-желтого цвета. Кристаллы гематоидина хорошо различимы как в нативном, так и в окрашенном азур-эозином препаратах. Так как обычно в СЖ эти кристаллы достаточно мелкие, нативные препараты рекомендуется микроскопировать на иммерсии. В очаге воспаления эти кристаллы могут быть фагоцитированы макрофагами или располагаться на поверхности клеточных элементов.
П р и м е ч а н и е 8 ─ При травме и внутрисуставном кровотечении в полости сустава создаются условия, при которых могут образовываться кристаллы гематоидина.
Кристаллы Шарко-Лейдена.
Кристаллы Шарко-Лейдена по форме напоминают стрелку компаса или резко вытянутый в длину ромб. Обычно кристаллы Шарко-Лейдена расположены на фоне детрита или в сочетании с большим количеством эозинофилов и образуются при распаде эозинофилов из эозинофильной зернистости, эти кристаллы можно обнаружить в СЖ больных, страдающих аллергическим синовитом.
Кристаллы лекарственных препаратов
Стероиды. Внутрисуставные инъекции стероидных препаратов приводят к их кристаллизации внутри суставов, где могут сохраняться до 10 недель. Обнаружение этих кристаллов при микроскопическом исследовании нативных препаратов и последующая неправильная дифференцировка может привести к ошибочным заключениям.
Неклеточные и некристаллические элементы в СЖ.
В СЖ могут быть обнаружены фрагменты хряща и поврежденных связок. Фрагменты хряща в нативном препарате можно распознать по характерному шелковистому блеску. Обнаруживают также фрагменты хряща, содержащие кластеры хондроцитов и фрагменты мениска, которые представлены волнистыми коллагеновыми волокнами и также хондроцитами; фрагменты связок представлены длинными тонкими фибриллами и параллельно расположенными нитями коллагена
П р и м е ч а н и е 9 ─ Встречаются наиболее часто в СЖ после травмы коленного сустава.
П р и м е ч а н и е 10 ─ Несмотря на высокую чувствительность метода поляризационной микроскопии, при его использовании возможны серьезные ошибки, которые обычно возникают из-за недостаточно высокой разрешающей способности конкретного микроскопа, наличия посторонних кристаллоподобных примесей и повреждений на предметном или покровном стекле. Микроскопист должен учитывать возможность помех и хорошо знать принципы распознавания кристаллов.
3.5.5. Микроскопическое исследование препаратов синовиальной жидкости, окрашенных азур-эозином (с подсчетом синовиоцитограммы).
Приготовление мазков СЖ и методы их окраски (п.5.5.2).
Клеточный состав синовиальной жидкости (синовиоцитограмма).
Определение клеточного состава СЖ – важнейший этап ее исследования, позволяющий уточнить диагноз, определить степень воспалительной активности процесса и прогноз. Определение количественного распределения клеток (синовиоцитограмма) является важнейшим показателем для дифференциальной диагностики болезней суставов. Подсчет процентного соотношения клеток проводят так же, как и подсчет лейкоцитарной формулы крови. (подсчитывают 100 клеток в мазке и рассчитывают процентное содержание каждого вида клеток).
В норме в СЖ преобладают клетки тканевого происхождения (синовиоциты и гистиоциты) – до 65%. Лимфоциты составляют около 30%, а моноциты и нейтрофилы – 1-2%.
Клетки крови в СЖ.
Нейтрофилы (полиморфноядерные лейкоциты).
Нейтрофилы в 1,5-2 раза больше эритроцита, по диаметру (14-16 мкм). Соотношение ядра и цитоплазмы сдвинуто в сторону ядра. Цитоплазма сиреневого цвета, заполнена мелкой, пылевидной зернистостью, имеющей окраску ядра клетки. Ядра состоят из 3-4 сегментов, с четким делением на окси- и базихроматин. При дистрофии количество сегментов в нейтрофилах резко увеличивается до 5-7 (гиперсегментация). При апоптозе в нейтрофиле фрагменты ядра сливаются в одну или две гиперхромные гомогенные, бесструктурные массы правильной круглой формы.
В нормальной СЖ количество нейтрофилов не превышает в формуле 1-2%.
П р и м е ч а н и е 1 ─ При ревматоидном артрите содержание нейтрофилов достигает 90%, а количество лимфоцитов снижается до 10%. Аналогичная картина отмечается при анкилозирующем спондилоартрите. При воспалительных заболеваниях и внутрисуставном кровотечении нейтрофилы составляют в формуле СЖ 60-80%, а при септической артропатии - более 95%.
Лимфоциты.
Это клетки до 12 мкм в диаметре. Соотношение цитоплазмы и ядра сдвинуто в сторону ядра (9: 1). Ядро грубо глыбчатой структуры, базофильная цитоплазма узким ободком окружает ядро, иногда просматривается зона просветления вокруг ядра.
В нормальной СЖ количество лимфоцитов колеблется от 8 до 30%.
П р и м е ч а н и е 2 ─ При воспалительных заболеваниях преобладают нейтрофилы, а при дегенеративных – лимфоциты. При дегенеративных заболеваниях суставов и травматическом артрите в СЖ содержание лимфоцитов достигает 85%. Преобладают лимфоциты в формуле также при токсико-аллергических синовитах и синовиальной форме туберкулеза. При артритах вирусной этиологии, например вызванной вирусом HTLV-1 - появляются атипичные лимфоциты, количество которых достигает 20%.
Моноциты.
П р и м е ч а н и е 3 ─ Моноциты встречаются при различных суставных артропатиях, в том числе при вирусных артритах и при моноцитарных артритах, а также при повреждении имплантационных протезов.
Кроме этих клеток в СЖ (при патологии) могут быть обнаружены в небольшом количестве другие клетки крови: эозинофилы, базофилы, плазматические клетки.
П р и м е ч а н и е 4─ Эозинофилы встречаются в СЖ крайне редко, идентичны эозинофилам периферической крови.
П р и м е ч а н и е 5─ Базофилы встречаются в незначительном количестве при воспалительных артритах, серонегативной артропатии, невоспалительных артропатиях, связанных с травмой.
П р и м е ч а н и е 6 ─ Плазматические клетки встречаются в СЖ при воспалительных артропатиях. Обнаружение плазматических клеток характерно, в частности, для ревматоидного артрита, т.е. для длительного вяло текущего воспалительного процесса.
Тканевые клетки в СЖ.
Синовиоциты.
Эти клетки относятся к однослойному уплощенному эпителию, покрывающему синовиальные оболочки суставов. По своей морфологии они идентичны мезотелиальным клеткам. Синовиациты - эпителиальные клетки диаметром 18-25 мкм, с различным ядерно/цитоплазматическим соотношением. Они содержат центрально или эксцентрично расположенные ядра круглой или овальной формы, мелко-глыбчатой или петлистой структуры, окруженные широким ободком базофильной цитоплазмы, иногда с «оборочкой» по периферии. Цитоплазма в перинуклеарной зоне у некоторых синовиоцитов содержит мелкую зернистость. Синовиоциты отторгаются от поверхности синовиальной оболочки сустава и обнаруживаются в СЖ при артропатиях. Синовиальные клетки могут содержать 2 и более ядер (многоядерные).
Различают три вида синовиоцитов:
тип А – макрофагальные синовиоциты, способные к фагоцитозу;
тип В – синовиальные фибробласты, способные к синтезу и секреции гиалуроновой кислоты;
тип АВ – переходные формы клеток, сочетающие эти оба свойства.
Гистиоциты.
Тканевые макрофаги – клетки размером 18-20-25 мкм с округлым или моноцитоидным компактным ядром, окруженным мелкозернистой или не содержащей зернистости цитоплазмой.
П р и м е ч а н и е 7 ─ Гистиоциты всегда присутствуют в СЖ при воспалительных процессах.
П р и м е ч а н и е 8 ─ В СЖ могут быть обнаружены многоядерные клетки, которые представляют собой синовиоциты или плазматические клетки и имеют такое же значение как и мононуклеарные варианты этих клеток.
П р и м е ч а н и е 9 ─ Обнаружение LЕ –клеток, содержащих в цитоплазме включения гомогенезированного ядерного материала, в СЖ в отличие от периферической крови, не является прямым указанием на СКВ. Однако сочетание LE-клеток с большим количеством лимфоцитов в СЖ позволяет заподозрить наличие у больного СКВ.
П р и м е ч а н и е 10 ─ Клетки в митозе.
Митотические фигуры не имеют диагностического значения. Синовиоциты в состоянии деления подтверждают процесс пролифераии клеток выстилки суставной сумки.
Недифференцируемые клетки.
Недифференцируемые клетки отмечаются практически во всех синовиограммах.
В тонких, хорошо сделанных мазках СЖ, фиксированных фиксаторами или фиксаторами- красителями и докрашенных азур-эозином, все клеточные элементы поддаются дифференцировке. Только в толстых мазках, приготовленных неопытной рукой лаборанта из вязкой, гиперклеточной и предварительно неразведенной СЖ, встречаются клетки, неподдающиеся дифференцированию. Это могут быть любые клеточные элементы - и тканевые, и кровяные. В таких препаратах практически невозможно обнаружить кристаллы и микроорганизмы.
